雞安卡拉病蜂膠自家苗的制備

王欣宇 穆國冬 張 瑩 賈淇元 任 銳*

1.吉林省畜牧獸醫科學研究院，長春130062；2.吉林省動物疫病控制中心，長春130062；3.吉林省白城市畜牧總站，吉林白城137000

雞心包積液－肝炎綜合癥是由I 群腺病毒Fav-4 型引起的一種傳染病，肉雞和蛋雞皆可感染，雞感染死亡可出現心包黃色積液，肝臟腫大并出現大量壞死的肝細胞。此病經常與禽白血病等疾病混合感染，混合感染死亡率可達30%，嚴重時可達80%～90%，已經成為危害我國禽類養殖業的重要疾病之一。

1 材料與設備

1.1 儀器設備

組織攪拌機、滅菌解剖刀、解剖剪刀、剪鉗、鑷子、酒精燈、托盤、37 ℃恒溫培養箱、漏斗、滅菌3層紗布、燒杯、量筒、攪拌棒、勻漿機、250 mL 和500 mL 滅菌疫苗瓶、移液器。

1.2 材 料

病死雞心臟及包膜、肝臟組織、蒸餾水、生理鹽水、3‰甲醛、雙抗（青霉素、環丙沙星），蜂膠，Tween-80，75%酒精。

2 自家苗的制作

2.1 組織處理

用滅菌解剖刀將肝臟組織切成小塊，放入滅菌過的組織攪拌機中絞碎成肉糜狀，倒入桶中按1:10的比例加入生理鹽水混勻。密封后放進-20 ℃冰柜冷凍，完全凍結后再取出融化，重復上述過程，反復凍融3 次。

凍融3 次后將解凍后的病料生理鹽水混懸液用3 層滅菌紗布過濾，棄去殘渣，在濾液中加入3‰甲醛，充分攪拌混勻，裝入適當容器內最后放入37 ℃恒溫培養箱滅活48 h，每隔2～3 h 用攪拌棒充分攪勻1 次。滅活完成后用3 層滅菌紗布進行二次過濾，棄去濾渣，用移液器抽取1 mL 濾液用于無菌檢查，玻璃棒均勻涂布普通肉湯培養基，放入37 ℃溫箱培養18～24 h,觀察有無菌落生長。剩余濾液中按1 000 UI/mL 加入雙抗（環丙沙星、青霉素），充分搖勻，放入4 ℃冰箱中冷卻備用。

2.2 蜂膠提純

取蜂膠塊敲打研磨粉碎，稱取重量，按比例加入95%乙醇，根據室溫靜置24～72 h，低速離心取上清液，得到蜂膠乙醇浸液。取1 平皿，內置1 張圓形濾紙，濾紙可折疊成風琴狀以加大與空氣流通面積。用移液器取1 mL 蜂膠乙醇浸液滴在濾紙上，濾紙放置入干凈平皿中，電子天平稱量平皿和濾紙總重量，將平皿放入37 ℃烘箱過夜，待濾紙完全烘干恒重后，再次用電子天平稱量平皿加濾紙重量，計算重量差，重量差即為每毫升蜂膠中干物質含量，算出蜂膠純度，并計算浸出液中蜂膠干物質含量。再用95%乙醇配成含蜂膠干物質20 mg/mL 的浸液，4 ℃保存備用。

2.3 自家苗的配制

取2.1 步驟處理過的滅菌組織濾液500 mL，加入蜂膠浸液110 mL、Tween-80，倒入容積2 L 的勻漿機中，充分攪勻3～5 min，可分檔間隔操作累計時長。室溫靜置，待表面泡沫消失后，根據實際需要分裝裝入500 mL 或250 mL 滅菌疫苗瓶，密閉封口后存于4 ℃待用，保質期一般不超過1 年。

3 無菌檢測及安全檢驗

3.1 無菌檢測

用移液器吸取疫苗成品，將疫苗分別接種于普通肉湯瓊脂和麥康凱營養瓊脂中各1 mL，滅菌玻璃棒均勻涂鋪，培養箱37 ℃培養18～24 h，均無細菌生長，可證明甲醛滅活完全，無菌檢測合格。

3.2 安全檢驗

選用30 日齡至60 日齡非免疫健康雞10 只，每只皮下注射疫苗1 mL，同時設立同樣日齡非免健康雞空白對照組10 只，每只注射生理鹽水1 mL。觀察7～10 d ，兩組雞精神均正常，食欲良好，亦未見任何不良反應，隨機剖檢免疫組雞注射部位及內臟均無任何肉眼可見的異常變化，對照組也健康無異常，表明疫苗安全。

4 結 果

該批疫苗完成安全試驗后，緊急接種發病雞場，全群免疫，每只雞按體重肌肉注射1～1.5 mL蜂膠疫苗，疫苗接種后，增加雞群日糧中的蛋白質和維生素含量，增加飲水量。5 d 后雞群臨床無新增病例且無新增死亡雞，說明此批自家苗對此病發揮了顯著作用，產生了較好的免疫防制效果。

5 討 論

制作自家苗所選取的病料都來自于本養殖場的發病動物分離出的病料組織，病料組織經過絞碎滅活后制備的疫苗，其抗原成分全面，基本包含了能夠引起本次疾病的病原，可以對動物進行全方位、多方面的誘導免疫保護。禽腺病毒在擁有多種血清型的情況下，各類商品疫苗均不能達到全面理想的免疫治療效果，自家苗正好可以彌補禽腺病毒商品苗血清型單一覆蓋不全的缺點，更好地提供應急免疫。

蜂膠屬于天然來源佐劑，是蜜蜂在樹干或綠植芽孢上采集樹脂，將樹脂處理后形成的具有芳香氣味的固體物，蜂膠免疫佐劑作為一種廣譜生物活性物質，具有良好的免疫增強作用，它能增強巨噬細胞的吞噬能力，促進抗體的產生，提高機體的特異性和非特異性免疫力。應用蜂膠或配合抗原引入機體，既能引起特異性免疫應答，又能啟動非特異性防御機制，能刺激免疫機制和丙種球蛋白活性，增加抗體產量，增強補體活性和吞噬細胞的吞噬能力。蜂膠所含的成分極其復雜，有研究表明，蜂膠本身無明顯抗原性和過敏性，毒副作用較小[1]。

蜂膠與抗原按比例混合接種于機體后，可以增強補體的功能，產生較多的抗體，提升血清抗體水平，是天然的免疫增效佐劑，并且具有抑菌性和更高的安全性。不同方法制備的蜂膠佐劑所產生的免疫效果也不盡相同，蜂膠佐劑的研究發展及應用也是適應疫苗的應用發展的，在獸醫臨床應用的蜂膠疫苗佐劑會隨著養殖業的發展、養殖技術的發展而更廣泛地應用到獸用疫苗當中。翟曉虎等[2]應用蜂膠黃酮作為PPV 滅活疫苗佐劑，可以提升豚鼠細胞免疫和早期體液免疫。

自家苗主要是針對個別養殖場的病原血清型而制造成的疫苗，在一定程度上可以起到很好的應急免疫作用，但也存在一定的缺點和應用范圍制約，因此在自家苗的制作和使用上應該做到合理應用，規范應用，不隨意擴大應用范圍，起到快速治療的輔助作用。