單細胞RNA測序在間充質干細胞研究中的應用

龍 笑 李竹君

1970年，Friedenstein等[1]在豚鼠的骨髓和脾臟中發現了可以在體外形成成纖維細胞群落、在體內形成異位骨組織的骨祖細胞。對該類細胞的進一步研究顯示，它們能夠以未分化的狀態復制，并具有分化形成多種間充質組織的潛能，包括骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉和骨髓，屬于間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)[2]。MSCs是成體干細胞，存在于骨髓、脂肪等多種組織中。國際細胞治療聯合會(International Society for Cellular Therapy, ISCT)提出的體外培養的間充質干細胞表型為：≥95%細胞表達包括CD105、CD73和CD90在內的標志物，≤2%細胞表達包括CD45、CD34、CD14、CD11b、CD19、CD79A以及HLA-DR19[3]。對MSCs的深入研究顯示，其具有修復組織損傷、通過分泌可溶性因子調節組織微環境、調節免疫等作用，引起了研究者將其用于干細胞療法的興趣[4～6]。MSCs在脂肪組織中含量較高，獲取方便，加之倫理學問題少、免疫反應弱等優點，極具應用前景。截至2020年2月，在Clinicaltrials.gov網站檢索Mesenchymal stem cells，可以找到1044條已完成或正在進行的間充質干細胞療法的臨床試驗。目前，MSCs主要用于脆弱組織的修復重建，包括肌肉骨骼系統、神經系統、心肌、肝臟、角膜、氣管、皮膚等[7]。

但是，體外培養的MSCs具有高度異質性及表型不穩定性[8]。來自不同個體、不同組織種類的MSCs具有不同的表型和性質。1999年，Phinney等[9]在小鼠中觀察到，不同個體骨髓中MSCs含量差異可達10倍，在成骨分化標志物堿性磷酸酶的表達水平、生長速率、表面標志物等方面也具有較大差異。隨后，他們又觀察了取自17名健康志愿者髂后上棘的人骨髓MSCs，發現其生長速率差異可達12倍[10]。由于MSCs的異質性和分離技術上的差異，如果應用于大規模臨床治療，效果可能參差不齊[11]。這一點大大阻礙了對它的研究和應用。

單細胞RNA測序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技術是打破這一困境的絕佳工具。2009年，Tang等[12]采用顯微鏡下手動分離單個細胞的方法，在二代測序的基礎上進行了第1例單細胞RNA測序。大體來說，目前單細胞RNA測序的操作包含4個步驟：①單個細胞的分離、捕獲；②反轉錄；③cDNA擴增；④測序文庫的構建。通過給每個細胞加上獨特的識別碼，實現針對單個細胞進行測序，可以從根本上解決困擾研究者的異質性問題。結合生物信息學分析等研究方法，單細胞RNA測序為多個領域的研究帶來新的契機。近年來，它被應用于發現新的細胞類群、動態觀察發育過程、研究基因調控機制、觀察隨機等位基因表達等多個方面的研究[13]。且隨著技術的進步，單細胞RNA測序逐漸從技術和價格上變得更加普及，研究者無需再過多關注測序方法，而可以將目光聚焦于生物學問題本身。本文將總結自單細胞RNA測序技術誕生以來在間充質干細胞研究中的應用，并展望其前景。

一、繪制細胞圖譜、鑒定細胞亞群

單細胞RNA測序數據包含樣本中每個細胞的轉錄組，可以用于了解樣本中細胞的基本信息，如根據算法進行分群、鑒別不同亞群的標志物、研究差異表達基因的功能及通路等，并作為參照數據庫，供之后的研究進行比對分析。Freeman等[14]于2015年對小鼠骨髓MSCs進行單細胞測序，發現多能性相關基因在骨髓MSCs單細胞之間的表達水平基本一致，但與成骨、成軟骨、成脂、神經及血管平滑肌分化相關的基因表達水平卻具有顯著差異，免疫調節相關基因的表達也不一致。該研究證實了MSCs的譜系分化預備，也提示將MSCs應用于臨床時應當謹慎小心——細胞間的異質性會導致治療效果的不確定性。Liu等[15]2018年對來自3名供者的24358個離體培養的脂肪來源間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)進行單細胞RNA測序，建立了ADSCs的轉錄組數據集，這對于研究ADSCs的異質性和譜系分化預備均有重要參考價值，為后續研究奠定了基礎。

二、觀察MSCs的譜系層級

MSCs并不是單一、靜止的干細胞群，而是分散于分化軌跡中不同位置的異質性細胞集群——從具有多能性的干細胞逐漸分化為組織細胞。Merrick等[16]通過對人類和小鼠脂肪間充質祖細胞進行單細胞RNA測序，發現群體中存在不同亞群，結合體內外功能試驗，定義了間充質祖細胞的譜系層級：由二肽基肽酶-4 (DPP4) 標記的細胞是高度增殖的多能祖細胞，較不易分化為脂肪細胞；細胞間黏附分子-1(ICAM1)標記的細胞為脂肪前體細胞，輕微誘導即可分化為脂肪細胞；CD142+細胞與ICAM1+細胞相似。體內試驗顯示，DPP4+細胞首先分化為ICAM1+/CD142+的脂肪前體細胞，再分化為脂肪細胞。由于間充質祖細胞分化介導的增生性生長(脂肪生成)對于脂肪組織的正常功能至關重要，該過程缺陷會導致脂肪纖維化和炎癥，進而導致胰島素抵抗，因此，靶向上述分子促進間充質祖細胞向脂肪細胞分化或許能夠改善代謝疾病。

Wolock等[17]對小鼠骨髓中的非造血細胞進行單細胞RNA測序，定義了非造血細胞的分群；結合計算模擬和細胞狀態層級，可以繪制出從間充質細胞到骨、軟骨和脂肪的分化軌跡，并確定各條軌跡中的關鍵轉錄因子。

三、細胞譜系之間的差異比較

比較不同來源、不同狀態的MSCs，或將MSCs與其他細胞譜系比較，有助于深入理解細胞特性的差異及其背后的機制，例如根據治療需要選擇具有不同特性的細胞系，指導臨床應用。Barrett等[18]通過單細胞RNA測序比較華通膠和骨髓來源的MSCs，發現436個差異表達基因參與免疫調節、血管生成、創傷愈合、凋亡、抗腫瘤活性和趨化作用等過程。其中，華通膠來源的MSCs中免疫分子的表達顯著高于骨髓MSCs。Zhou等[19]比較了人脂肪和骨髓來源MSCs的單細胞測序資料，和兩種細胞在臨床應用上的特性。測序揭示了以下不同點：脂肪來源的MSCs比骨髓來源的MSCs異質性更低，更不依賴于線粒體呼吸產生能量，表達HLA-Ⅰ類抗原水平更低，免疫抑制作用更強。在治療骨關節炎方面，脂肪來源的MSCs療效更加穩定。Zhao等[20]比較了胚胎和成體骨髓MSCs，發現二者具有很大差異。通過分析差異表達基因，發現成體骨髓MSCs表現出更活躍的血管分化和細胞運動。由此可以推測，在血管相關領域，成體骨髓MSCs的應用潛力更大。

Sisakhtnezhad等[21]使用單細胞RNA測序比較小鼠精原干細胞與MSCs的差異表達基因和轉錄調節因子，以MSCs為對照，找到了精子發生過程、細胞類型轉換中的重要因子。Xiao等[22]通過比較無菌小鼠和無特定病原體小鼠的骨髓MSCs，發現菌群對于干性的維持有重要作用；將無特定病原體小鼠的菌群移植給無菌小鼠，則其骨髓MSCs的增殖和分化能力恢復正常；菌群還通過誘導活化的T細胞凋亡和分泌細胞因子維持骨髓MSCs的免疫調節功能。

四、觀察MSCs的組織分布與作用

越來越多的組織中發現了MSCs的存在。單細胞RNA測序可以發現組織中新的細胞類群，包括MSCs，并進一步分出亞群；通過生物信息學方法分析各亞群高表達基因參與的通路、生物學過程等，可以推測MSCs參與了哪些生物學過程及其機制。

Liu等[23]對妊娠早期和中期的人胎盤進行單細胞測序，發現其中除了已知的多種細胞及其新亞群，還有間充質基質細胞。Shafiee等[24]研究發現人類足月胎盤中存在中內皮雙能祖細胞，在體外可分化為內皮組織和間充質組織，且向間充質分化的過程不受經典的內皮-間充質轉化因子TGF-β通路的調控。Kameishi等[25]在角膜緣上皮組織中通過單細胞測序發現，至少有兩群細胞的表型類似不成熟的上皮/間充質組織細胞，為傳統認識的角膜上皮干細胞中新的亞群。有研究者對體外傳代培養的人軟骨細胞進行測序發現，絕大多數細胞具有間充質干細胞的標記，且能夠被誘導分化為骨細胞和脂肪細胞，說明該細胞符合ISCT提出的鑒定標準，可以被稱為間充質干細胞。

Gu等[26]對血管旁脂肪組織進行測序，發現其中存在間充質干細胞，且其中一個亞群表達與平滑肌分化相關的重要通路，這說明間充質干細胞可能通過分化為血管平滑肌細胞來維持血管的生理功能。對小鼠靜脈移植模型進行MSCs移植，可以觀察到MSCs通過平滑肌分化對血管重塑的作用，且分化過程受到TGF-β1和miR-378a-3p的調控。

牙泡中存在間充質祖細胞，它們參與形成根骨界面，并通過自分泌/旁分泌的甲狀旁腺素相關肽(PTHrP)及其受體調節牙齒萌出的過程[27]。Takahashi等[27]通過單細胞測序發現，牙泡細胞中PTHrP+的亞群也表達高水平的PTH/PTHrP受體(PPR)，結合細胞譜系分析等方法，得出牙泡中的間充質祖細胞通過PTHrP及其受體的自分泌/旁分泌途徑維持自身的生理功能和細胞命運的結論。

Kayaba等[28]通過共培養等試驗發現骨髓中PDGFRα+Sca-1+間充質干細胞具有促進漿細胞存活并分泌抗體的作用，為推測其中可能的分子和通路進行單細胞RNA測序，發現PDGFRα+Sca-1+間充質干細胞具有異質性，其中一群細胞表達Vcam1、Nes和IL-6等與漿細胞和造血干細胞密切關聯的基因，ELISA證實，PDGFRα+Sca-1+間充質干細胞可分泌IL-6。

五、觀察MSCs的誘導分化過程

MSCs在合適的誘導條件下，可以分化為間充質以外的組織，是再生醫學，尤其是組織工程中極具應用前景的種子細胞。Li等[29]從人脂肪組織中獲取了一種新的MSCs，并將其誘導為有功能的肝細胞，使用單細胞RNA測序觀察分化過程中基因表達譜的變化。不同于以往報道的MSCs，這種新的類群處于常染色質狀態，具有表觀遺傳多能性，并表達多能性標志物MYC、KLF4和GMNN。基因本體分析顯示，MSCs分化為肝細胞全程中的事件中，如KLF4和GMNN等多能性相關基因的表達水平逐漸降低直至消失，而血管生成、膠原纖維合成等基因的轉錄水平逐漸升高，肝臟發育的關鍵基因ATF5于誘導后3天開始表達。誘導后5～9天之間基因表達的變化最大，與肝細胞譜系特化有關；9～13天時，與肝細胞功能相關的基因，如脂質運輸、維生素代謝、脂質合成、膽固醇調節等相關基因的表達開始上調。該研究將單細胞RNA測序應用于MSCs分化的過程中，揭示了細胞發育和轉換中的變化和機制。

六、展 望

單細胞RNA測序技術的誕生與不斷革新使得分析復雜樣本中千萬余單個的細胞成為可能。不斷有更加靈敏、更加自動化的方法和技術產生，使研究者可以用更短時間獲得更多更加精確的數據。單細胞RNA測序將精度提升，以生命活動的基本單位——細胞為單位來分析，可以避免單個細胞的特征被掩蓋，觀察到細胞與細胞、細胞與環境之間的復雜交流等多種重要的信息。該技術在多個領域的應用將產生一大批對未來具有極大影響的知識，如腫瘤、免疫、胚胎發育、再生醫學等。在MSCs研究領域，單細胞RNA測序技術的應用可以解決異質性問題，將細胞群體進一步細分，分析不同來源、不同亞群MSCs的特點，尋找新的細胞標志物，針對不同患者、不同治療需求選擇不同細胞，助力再生醫學、精準醫學的發展；研究MSCs的組織分布、參與的生物學過程和機制可能促進對干細胞生理功能與不同條件下作用的理解，并找出可能有效的干預靶點，為疾病的治療方法提出新的假設；MSCs作為再生醫學中極具潛力的種子細胞，通過單細胞RNA測序觀察其誘導分化過程可以為新的治療手段打下理論基礎。

展望未來，單細胞RNA測序技術必然在精度和成本上有進一步的提升，其普及將為自然科學研究帶來新的飛躍。