鈣黏素亞型2在干細胞分化中的作用

柳 鑫 臧春逸

細胞間粘連可以調控單一細胞進一步合成組織，在組織結構與形態發生中起重要作用。細胞與細胞間或細胞與間質間的相互作用通過細胞粘連分子(cell adhesion molecules,CAMs)來調節。這些細胞粘連分子包括鈣黏素、整聯蛋白、選擇蛋白和免疫球蛋白樣CAMs。細胞與細胞或與間質間的相互作用可調節細胞的多種行為，如：增生、分化、凋亡、細胞極化，總體來說其目的是保持組織的完整[1，2]。

鈣黏素亞型2(cadherin-2，CDH2)是一種鈣離子依賴跨膜糖蛋白，是粘連蛋白家族中的一員。它的作用是通過形成粘連帶(adherens junctions,AJ)來調節鈣離子依賴的親同種抗原的細胞間的相互作用。細胞在不同狀態下鈣黏素的表達水平也不同，尤其當細胞從一種狀態向另一種狀態轉換時，例如上皮間充質轉換表現為CDH2過表達。鈣黏素的表達與細胞間的粘連在干細胞分化或成熟細胞向多潛能細胞的轉化中起作用[3，4]。

干細胞分化受局部微環境中可溶性及非可溶性信號的影響。除了可溶性生長因子，許多精煉的研究中還牽扯到細胞與細胞外基質相互作用以及干細胞譜系分化傳遞的底物動力學[5]。粘連帶在胚胎干細胞再生、細胞重組、造血干細胞植入和間充質干細胞分化成肌肉過程中均起作用[6，7]。對CDH2在干細胞分化中的作用進行介紹，旨在其對指導控制干細胞分化的新技術的產生與設計出納米仿生材料，并將其應用于組織工程與再生醫學方面有潛在價值。

一、粘連帶：信號轉導與機械感應

CDH2包含細胞質區域和外功能區，外功能區包含5個串聯的細胞外鈣黏著蛋白(EC)區域[8]。EC區域包含鈣離子結合位點，3個鈣離子作為區域間的連接者，可穩定外功能區的結構，保護它不被蛋白水解。最外層的EC1區域調節相鄰細胞間鈣黏著蛋白間的相互作用，進而在平行且相反的細胞膜間行成粘連帶[9]。CDH2特定地在間充質類的細胞如成纖維細胞和心肌細胞上表達，并調節相同細胞間粘連，如肌成纖維細胞，或不同類型細胞間的粘連，如肌成纖維細胞與心肌細胞[10]。

鈣黏著蛋白間的作用會通過板盤突出啟動開始，并引起細胞間通路的激活，最終形成鈣黏著蛋白間肌動蛋白簇。鈣黏著蛋白間的聯系促進粘連帶的形成并穩固粘連帶。而肌動蛋白聚集會使粘連帶擴張與成熟，進一步穩固并矯正相鄰細胞膜。另外，b鈣黏著蛋白與鈣黏著蛋白細胞質尾部相結合并作用于a鈣黏著蛋白，來調節肌動蛋白細胞骨架[11]。鈣黏著蛋白細胞內的區域與P120鈣黏著蛋白結合，使鈣黏著蛋白與微管相連，并調節GTP酶Rho、Rac1、Cdc42。擾亂Rac或Rho活性會影響AJ合成，Cdc42則會影響AJ穩定[11]。GTP酶的功能是與鈣黏素相連進而控制不同的細胞活動包括極化、遷移、凋亡[12]。CDH2通過p120與b鈣黏著蛋白依賴信號通路來調節極化信號。CDH2調節的細胞粘連對于組織整體的遷移是重要的。

研究表明鈣黏素受生長因子的影響，并與生長因子受體相作用進而激活信號通路。當暴露于切斷應激環境，上皮鈣黏著蛋白與血小板內皮細胞粘連分子(PECAM-1)和血管內皮生長因子受體(VEGFR2)結合，這一復合體會引起整聯蛋白激活，致使肌動蛋白細胞骨架重組[13]。在上皮細胞，表皮生長因子受體(EGFR)與CDH1行成復合體進而激活MAPK通路，進而與細胞生存或EMT相關[14]。成纖維細胞受體(FGFRs)在神經突生長時可以刺激CDH2、FGF通過加強穩固在AJ位點的上皮鈣黏素對于保持血管的完整性起重要作用[15]。肝細胞生長因子(HGF)調節細胞粘連分子上皮-鈣黏著蛋白的表達，進而影響內皮細胞的活性、遷移與血管再生。最后，轉化生長因子β1(TGF-β1)可以通過提高CDH2水平增加角化細胞遷移，而這一作用可以被EGF抵消[16]。

多項研究表明，鈣黏素不僅受化學因素調控也受物理因素調控。近年來研究表明，底物強直可以通過c-jun氨基端激酶(JNK)磷酸化水平在培養基及在體內或體外的表皮組織中調節上皮細胞間AJ的形成[17]。強直的底物導致JNK激活和AJ消失，而柔軟的矩陣抑制JNK活性導致AJ合成。這一結論在生物工程表皮與(jnk1-/-或jnk2-/-)敲除鼠表皮中已得到驗證。由此得出結論，JNK通路所調節的底物的僵硬度在體內外均有影響AJ合成的效應。這些發現可以幫助理解在組織發育過程中AJ的形成與消除的機制，也可以在三維水平上通過控制細胞間與細胞與底物間粘連，從而發現促進組織再生或抑制腫瘤浸潤的治療策略。

眾所周知底物僵直可以影響焦點粘連，另有實驗證實它也可以影響鈣黏素調節的細胞間粘連。通過肌動蛋白收縮，底物僵直可以影響依賴鈣黏素的整體細胞遷移。CDH2被看作是一種機械反應的受體，當壓力通過CDH2傳導，粘連帶的作用與整聯蛋白-ECM復合體的支撐作用是相同的?？傮w說來，僵硬的底物可以造成較大的牽引力，較大的細胞播散區，生成更多的CDH2連接帶[18]。

最后，了解以鈣黏素為基礎的細胞間的相互作用對于發展無支架組織工程相關的新型治療方案是有幫助的。這些新的治療方案基于細胞應用無支架技術如形成球體或生物打印進行自我合成，進而形成有結構的組織[19]。

二、CDH2在間充質干細胞分化中的作用

鈣黏素可以調節干細胞穩定性及分化。間充質干細胞為治療骨與軟骨類疾病、心肌梗死、腦卒中、風濕性關節炎、急性肺損傷、器官移植疾病、皮膚移植排斥等提供細胞治療的細胞來源[20～22]。間充質干細胞在組織修復中發揮作用需要遷移到組織損傷的部位，研究證實多種細胞的遷移與增生的潛能要受CDH2調節。間充質干細胞具有分化潛能和抗炎作用。當間充質干細胞培養成球體時它的分化潛能與抗炎作用會加強[23]。CDH2對于在關節滑液中成纖維細胞面對炎癥時起作用是至關重要的，CDH2在肌源性細胞分化過程中起重要作用。細胞密度大可以促進成肌細胞分化，提示鈣黏素調節的細胞間接觸可以影響肌肉生成。CDH2在創傷愈合中成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化中起重要作用，可以增加創面的收縮促進創面閉合[24]。

CDH2在干細胞分化中起重要作用，因此可以挖掘細胞間的作用來控制干細胞分化的技術。包括以下兩方面內容：①鈣黏著蛋白表面工程控制干細胞分化；②表面微拓撲工程控制細胞間粘連的范圍和信號。

1.鈣黏著蛋白表面工程控制干細胞分化：當CDH1在上皮細胞中聚集時，固定的鈣黏素會誘發信號發生瀑布反應。鈣黏素與Fc抗體結合生成融合蛋白可以使鈣黏素固定到細胞表面。另外，為了生成有功能的表面物質，固定的鈣黏素可以把其他連接蛋白激活的通路與鈣黏素調節的信號通路分開。鈣黏素調節的連接蛋白激活的通路結果是在細胞間接觸過程中生成AJ[25]。

CDH2與Fc結合形成的固定融合蛋白保留了CDH2本身的粘連特性，使β-聯蛋白、α-聯蛋白和P120在細胞間接觸部位聚集。成肌調節因子SRF表達升高可以證明CDH2-Fc結合形成的球形蛋白使成肌細胞成熟。在脂肪雙層細胞膜中的CDH2可以誘導骨軟骨前體中的間質細胞凝集[26]。有研究證實固定的鈣黏素以劑量依賴的方式促進MSC分化成SMC。所以可以通過改變表面物質的構成與細胞密度控制干細胞分化。因此，鈣黏素制動可以指導或調節干細胞分化，可以在組織工程與再生醫學領域中利用這一作用機制制造有功能的生物材料。

2.細胞表面微拓撲工程控制細胞間粘連范圍與信號轉導:微細加工技術使得在微米與納米水平控制細胞間粘連范圍成為可能。這種方法在控制細胞-基質間相互作用方面得到廣泛應用，而細胞與基質間相互作用對于干細胞分化是至關重要的。鮮有研究應用幾何微圖形來控制細胞間粘連，并評價細胞間粘連對干細胞分化的影響[27]。

有研究表明微島的大小與細胞分散的程度密切相關，在較大的島上，CDH2的表達可以引起間充質干細胞向肌源性或軟管源性細胞轉化，而在小島上則向脂源性細胞轉化。通過控制微島的幾何形狀與大小，細胞間接觸會增加，進而增加了軟骨源性細胞的分化[28]。然而控制細胞間的作用除了考慮微圖形的大小還要考慮細胞的密度。因此，細胞分散程度會隨細胞島大小改變而變化。所以，細胞間作用對細胞與底物間粘連的影響相矛盾，使得調節它們間的作用具有挑戰性。一些新的幾何形狀已被用來控制細胞間接觸的范圍，而不需考慮細胞密度或細胞分散區域[29]。因此可以用來確定細胞間粘連范圍與干細胞分化的關系。

三、實時監控細胞間粘連所調節的干細胞分化

理解細胞間粘連如何影響干細胞分化需要找到實時量化監測干細胞分化的方法。尤其是監測微圖形表面的單個小細胞的方法是非常有用的。另外，監測單個細胞技術在處理胚胎異質性、誘導干細胞多能性、成人干細胞相關研究上非常有價值，同樣對于區分不同分化潛能的細胞是有幫助的。

慢病毒排列技術可以監測在干細胞分化過程中的激活的基因或通路。新型慢病毒雙重促進質粒(LVDP)，可以定量測量一種基因促進因子(Pr)的活性，或轉錄因子(TF)結合部位(反應原件，RE)，而無需考慮每一個細胞中基因的數量。二代慢病毒質粒(shLVDP)可以通過在多環西素中敲除伴隨基因的辦法來實現動態監測Pr或RE活性，由此發現在干細胞分化過程中涉及的基因[30]。除此之外，在聚合反應中慢病毒粒子的表面可以設計成以共價鍵的方式與纖維素水凝膠結合，進而生成慢病毒排列，可以測量多種參與炎性反應中Pr或RE的活性。近年來，筆者發現了一系列Pr或RE庫來監測干細胞向脂源性、軟骨源性或肌源性分化過程，并識別出在分化中的新的通路[30]。這一技術與新的微細加工方法可以確定細胞間粘連程度是如何影響成人干細胞分化，腫瘤干細胞或人誘導多能干細胞(hiPSC)分化，還有如何影響對于細胞重組有重要作用的干細胞多潛能性網絡。

四、展 望

盡管一些研究聚焦于底物僵直對干細胞生物學的影響，細胞間粘連在引導干細胞再生或分化中的作用還是不清楚的。此篇聚焦于CDH2作為干細胞分化的調節因子作用。需要更多的研究來闡明細胞間粘連如何影響間充質分化，進而了解哪些分子通路參與其中。這些研究也將通過調節鈣黏素調控的粘連范圍，設計出能夠引導間充質分化的產品，將其應用于組織工程或再生醫學。筆者所在團隊通過進行子宮內膜瘢痕組織與正常子宮內膜的基因芯片與microRNA芯片檢測，篩選出在子宮內膜瘢痕組織中CDH2顯著高表達，且子宮內膜損傷越嚴重，CDH2的表達水平越高，提示CDH2在子宮內膜損傷修復過程中，可能存在CDH2通過調節相關分子通路使得子宮內膜間充質細胞分化成肌肉組織，形成宮腔粘連帶即子宮瘢痕。CDH2的上游靶向負調控microRNA為miRNA543,設想當子宮內膜面臨損傷時轉染miRNA543會使得CDH2表達下降，從而間充質細胞分化成肌肉組織減少，即瘢痕組織減少，減少對宮腔形態的影響以及對子宮肌層收縮的功能影響，從而改善致病因素對子宮內膜損傷的結局。最終期望通過對CDH2功能的研究，或許可以幫助設計出改善子宮內膜損傷修復結局的產品，應用于子宮內膜損傷的患者中，幫助患者保留子宮的生殖及生理功能。