非洲豬瘟實時熒光PCR 檢測關鍵要素和實驗操作注意事項

莫榮艷

（來賓市動物疫病預防控制中心 546100）

PCR（聚合酶鏈反應）技術自從1985 年問世以來，經過三十幾年的發展，已成為實驗室的常規技術。 近年來，PCR 技術有了重大改進。 實時熒光定量PCR 的原理是一種實時監控核酸擴增的技術，在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化對PCR 過程進行實時監控，以此實現對初始模板的定量分析。

1 實時熒光PCR 與普通PCR 相比， 實時熒光PCR 具備幾個方面的優勢

實時熒光PCR 采用封閉的檢測模式，閉管反應，杜絕污染；因此擴增產物導致污染的可能性比普通PCR 要小得多。 擴增產物的檢測在PCR 擴增過程中同時進行，并且數據的采集、分析全部由儀器自動完成，快捷方便無需電泳，40～60min 完成；檢測方法多樣， 應用靈活。 整個檢測所需的時間比普通PCR 要節省許多。實時熒光PCR 檢測模式功能強大，高準確度是目前公認的定量標準；具備定性、定量等檢測功能。 而普通PCR 要完成上述項目需采用不同的技術平臺。

2 非洲豬瘟實驗室檢測關鍵要素

實驗室的設計及設施設備、人員的檢測能力等都對檢測起到關鍵的要素。 實驗室設計及規劃非常重要，因為實驗室的分區可以減低因污染而導致的實驗失敗。

2.1 可以將實驗室分為四個區域，各區功能如下

試劑配制區：擴增試劑的配制，分裝和保存。需要的設備有：冰箱、生物安全柜、微量移液器、離心機。

樣品處理區：樣品處理和加樣。需要的設備有：生物安全柜、微量移液器、離心機、水浴鍋、振蕩器、可移動紫外燈、勻漿研磨機。

核酸提取區樣品核酸提取。 需要的設備有：生物安全柜、自動核酸提取儀（沒有這個儀器也可人工核酸提取）。

核酸擴增與分析區：核酸上機擴增并分析結果。 需要的設備有：熒光PCR 儀、UPS 電源（以防止由于電壓的波動或停電影響熒光PCR 儀的壽命）、生物安全柜、微量移液器、離心機2 臺（一臺可離心單管、8 聯管，另一臺可離心96 孔板）。

2.2 檢驗員要求

需要大專以上的獸醫或微生物相關專業，易于了解檢測對象的背景；動作麻利，有耐心，原則性強的人，能夠嚴格遵守操作規程；充分的培訓，是得到可靠的實驗室檢驗結果的前提。

2.3 待檢測的樣品要符合要求，不能受污染、破損、變質等情況

2.4 對試劑做敏感度的驗證

新的試劑與舊的試劑進行實驗比較；用已知陽性樣本，將樣品進行一系列的稀釋。 用新、舊試劑組成的兩個檢測系統同時進行測定，新、舊系統對同一份樣品的檢測時間差異不超過2h，已保證結果的可靠性；比較2 種試劑的檢測結果差異。

2.5 符合率驗證：用不同廠家的檢測試劑做比對

2.6 PCR 實驗污染預防： 嚴格分區實驗室及嚴格遵守工作程序

3 實時熒光PCR 實驗操作注意事項

3.1 各區域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染。實驗中牽涉的有毒有害及有污染的樣本及試劑應該嚴格按照生物安全相關規定操作和處理。 在試劑配制區和樣本處理區配備負壓式生物安全柜，以防止對環境或對樣品的污染。

3.2 要嚴格防止氣溶膠交叉污染。不要在生物安全柜以外開啟試劑或PCR 管； 禁止在熒光定量PCR 結束后打開PCR 管蓋，反應后的PCR 管應當直接廢棄，切不可在實驗區域內開啟。

3.3 檢測試劑使用前在常溫下充分融化并混勻，PCR 反應液容易失活，使用時應置于冰盒架上。 嚴禁使用超過有效期限的試劑；不同批號的試劑請匆混用。 試劑打開使用后應盡快用完。

3.4 所有試劑常溫下融化在開啟之前都要瞬時離心；吸取反應液等試劑時，盡量避免產生氣泡。 熒光探針加完后應該盡快避光保存，加入反應液后盡快上機，以防探針粹滅。

3.5 擴增試劑準備時應按陰性對照、待檢核酸、陽性對照的順序加入PCR 反應管中。PCR 管上方不能用記號筆標記；如果是8 聯排管或96 孔板可在板的邊緣兩端做小的標記；PCR 管使用平蓋，96 孔板使用光膜，不要裸手觸摸光蓋或光膜表面；不能帶乳膠手套蓋板或蓋光膜， 手套上有粉末會影響實驗過程中光的吸收，可以帶一次性PE 手套來按壓PCR 反應管蓋或光膜。

3.6 上PCR 儀前，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發造成結果不準確。加樣好的PCR 管要放在離心機上離心15s秒。 PCR 管或8 聯排管放置PCR 儀內要平衡對稱。

3.7 檢測過程中使用過的吸頭、 離心管等物品應放到盛有IO%次氯酸的廢物缸內，檢測結束的PCR 反應管，切忌開蓋，其他廢棄物品滅菌后做無害化處理。 檢測結束后，立即對工作臺清潔。 工作臺及各種實驗用品應定期用75%酒精或紫外燈進行消毒。

綜上所述，把控好非洲豬瘟實驗室檢測關鍵要素，就能提高工作效率，避免環境污染；在進行熒光PCR 實驗時把操作注意事項這些細節做好，就能提高實驗的準確率和時效率，避免樣品和試劑對環境的污染，也是對檢測人員的安全負責。 對每個細節的專注，才能提高檢測人員的專業技術水平。