血小板保存技術的應用研究進展

劉 磊

血小板是人體血液重要的組成成分，臨床輸注血小板能有效預防出血或止血、修復血管壁并促進血栓形成，在糾正凝血功能障礙、大失血搶救及外科手術治療中均發揮著重要作用[1-2]。血小板輸注在戰時傷病員的止血、預防出血，提高傷病員救治率、生存率上也具有積極的促進意義[3]。隨著我國各地區血液管理部門及醫療機構臨床合理用血的嚴密落實，使得成分輸血覆蓋了大中城市的各級醫療機構。傳統的血液資源如全血、紅細胞及血漿等得到更充分、合理地使用；同時也導致血小板、冷沉淀及白蛋白等血液制品的需求量顯著提高。現階段我國各地區采供血機構的血小板采集工作普遍存在著諸多困難，短時間內迅速擴張血小板獻血員群體難以實現。血小板來源有限，因其儲存時間短、儲存條件要求高，導致臨床用血中出現血小板過期浪費或失效無法使用的情況，也會嚴重影響患者的及時救治。因此，血小板保存技術的深入研究已逐漸成為全球學者廣泛關注的熱點項目。本文將對現階段血小板保存的主要方法與技術手段進行綜述。

1 液態儲存血小板

1.1室溫保存 目前，我國各地區采供血機構及醫療機構的血小板的常規保存條件均為(22±2)°C，振蕩保存，有效保存期限僅為5 d。室溫下保存過程中血小板的結構與功能會發生一系列改變，又被稱為血小板的儲存損傷。這些改變主要包括血小板形狀由圓盤狀可逆地變為球形或分解為碎片狀，血小板發生聚集、功能活化，以及糖酵解導致的乳酸濃度升高、pH值降低等代謝變化[4]。血小板儲存損傷的發生機制十分復雜，血小板處理過程中采集方法及儲存介質、容器的選擇、病原體及白細胞的減少均可能對這些改變產生影響。

室溫下儲存血小板主要依賴血漿或血小板添加劑溶液(platelet additive solution， PAS)與血漿聯合作為介質。PAS替代血漿成為血小板保存懸液的主要優勢是可將節約的血漿用于臨床治療，有助于臨床開展合理用血工作，能有效降低患者輸注異體血漿導致的輸血不良反應發生風險，提高用血安全。PAS目前已經由初代的PAS-A發展至PAS-G。不同代的PAS主要由不同比例的氯化鈉、醋酸鈉、枸櫞酸鈉、氯化鉀、氯化鎂、磷酸鹽、葡萄糖酸鈉、葡萄糖、碳酸氫鈉等成分組成，這些物質協同發揮抗凝、穩定細胞膜結構、提供代謝底物及緩沖活性、抑制血小板活化等功能[5-6]。研究表明，保存于65%PAS-F和PAS-C的血小板功能與保存于100%血漿中的血小板功能無顯著差異[7-8]。PAS應用于血小板儲存能有效降低血小板臨床輸注后過敏反應、非溶血性發熱及急性輸血反應等不良反應發生率[9-10]。此外，血小板懸浮于PAS中儲存時，促使纖維蛋白原等支架蛋白無法貼壁；若存在細菌污染則使其容易在上清液中繁殖，更有助于血小板儲存過程中的細菌污染檢測[11-12]。新一代PAS的研發能否有效減少或清除血小板中病原體污染值得關注[13]。

1.24℃冷藏保存 20世紀60年代末，Murphy和Gardner[14]指出人體輸注4℃冷藏保存的血小板相比于輸注22℃振蕩保存的血小板在體內有效存活時間大大縮短，可由7～9 d縮短至2～4 d。臨床預防性輸注血小板要求輸注后的血小板在血液循環中盡可能有較長的存活時間，這使得4℃冷藏保存血小板的臨床應用受到了廣泛質疑。然而，隨著血小板臨床需求量的增加及相關研究的深入，4℃冷藏保存血小板再次受到越來越多學者的關注。

大量的體內外實驗研究表明，冷藏儲存血小板相比于室溫儲存血小板的黏附、聚集功能更佳，更有助于減少出血時間[15]；同時，冷藏儲存血小板也能有效減少細菌污染，且無須振蕩保存，較室溫儲存血小板代謝水平更低，乳酸及炎癥介質等代謝物質的積累更少[16]。國內文獻報道，4℃冷藏保存21 d的懸浮紅細胞具有很好的止血功能，這源于懸浮紅細胞內殘存的血小板有效發揮了凝血功能[17-19]。4℃冷藏保存10～14 d的血小板與22℃振蕩保存的血小板相比，其血小板計數、細胞形態、膜及胞質結構比較差異無統計學意義。且4℃冷藏保存血小板具有代謝慢、葡萄糖消耗低、乳酸產生少且pH降低減緩等優勢，并具有更佳的聚集、止血功能和血小板活性[20-22]。預防性血小板輸注治療時，室溫保存的血小板仍較冷藏保存血小板療效好，那么，如何將冷藏保存血小板合理應用于臨床呢？Montgomery等[23]指出，冷藏血小板具有更強的聚集功能，用于急性出血或低血容量休克搶救時能有效控制活動性出血；相比于室溫保存血小板更有助于血栓迅速形成，從而發揮凝血、止血的功能。血小板臨床輸注治療時，可結合患者的實際情況，使用冷藏儲存血小板與室溫儲存血小板。活動性出血患者更多地使用冷藏儲存血小板，不僅更有助于止血，也可延長血小板的保存時間至10～14 d。預防性輸注治療的患者則使用室溫儲存血小板，可有效提高血小板在外周血中存活時間，更好地發揮預防出血的作用。現階段我國尚且空缺4℃冷藏保存血小板的技術規范與應用指南，應盡快制定相應的政策、指南與規范，推動4℃冷藏保存血小板技術的深入研究，對減少血液資源浪費、充分合理應用血小板資源、提高臨床救治能力十分必要也迫在眉睫。

2 冰凍保存血小板

二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide， DMSO)冰凍保存血小板的方法最早在20世紀70年代由美國海軍研制，是將血小板懸液中加入DMSO進行冰凍保存，使用時先解凍除去DMSO[24]。在解凍前除去大部分DMSO能省去許多解凍后的操作程序，具有能減少設備使用和人員培訓的顯著優勢[25]。體內外實驗結果均證實，冰凍保存血小板解凍后能發揮一定功能，較液態儲存血小板與凝血因子V具有更高的結合能力，并在ADP刺激后能夠產生更多的血栓素A2[26-27]。一項納入32名志愿者的臨床試驗結果顯示，分別輸注冰凍保存血小板和液態儲存血小板24 h后，血液循環中冰凍保存的血小板含量顯著少于液態儲存的血小板含量，但二者在外周血中持續存活的時間僅有微小差別[28]。

目前，關于冰凍血小板應用于活動性出血的臨床研究報道仍然較少。一項前瞻性臨床隨機對照試驗結果表明，在心臟手術后需要進行輸血治療的患者中，24例輸注冰凍保存血小板患者的出血量顯著少于29例輸注液態儲存血小板患者的出血量；但輸注冰凍保存血小板后患者的血小板增量總體表現更低，且血小板在體內存活的趨勢也不夠理想[29]。因此推測冰凍血小板具有更佳止血功效的機制是血小板在解凍過程中已經發生了“預激活”，這使得血小板在輸注后能迅速地與血管內皮細胞結合發揮止血作用，而體外實驗中冰凍保存血小板與凝血因子V具有更強的結合能力，從而在ADP刺激后產生更多的血栓素A2增強促凝活性也有力支撐這一假設。

現階段冰凍保存血小板的臨床應用仍然面臨諸多難題，如尚且缺乏大樣本量、中長期的臨床研究來證實冰凍血小板應用的可行性及安全性。有學者擔憂冰凍保存血小板輸注后盡管能夠促進凝血，但形成的血栓很可能較為脆弱，容易增加后期出血的概率。輸注冰凍血小板若在治療后期導致血液處于高凝狀態，則會引發血栓性疾病，但目前的臨床研究還無法進行有效評估。人們熟知DMSO具有神經毒性、腎毒性及心臟毒性，盡管冰凍血小板中DMSO的含量遠低于1.0 g/kg的毒性劑量，但長期大量冰凍血小板的輸注安全性仍然有待深入研究。

3 冷凍干燥保存血小板

由于凍干制品能夠常溫下保存、性能穩定且便于運輸，使得冷凍干燥技術愈來愈廣泛地應用于各種生物材料和制品的保存，并且已經在某些血液產品、疫苗領域取得了良好的效果[30-31]。20世紀50年代就有學者開始著手進行凍干血小板的研究，但經凍干處理后的血小板卻失去了原有的生物學活性[32]。近年來隨著冷凍干燥技藝的不斷進步與發展，臨床救治中對血小板需求的增加及戰時及非戰爭軍事行動中的血液保障能力要求的提高，使得國內外越來越多的學者開始關注凍干血小板的研究。

研究表明，凍干血小板復水化后幾乎保持著正常的形態，并具有良好的黏附性，但血小板聚集與活化功能均受到不同程度地損傷[33-34]。相比于新鮮血小板，復水化后的凍干血小板激活后僅能產生少量的血栓素和P-選擇素，且具有一定的促凝作用[35]。由于復水化過程中血小板的活化，從而導致GPⅡb-Ⅲa表達量僅相當于新鮮血小板的1/2，并且在凍干血小板活化后GPⅡb-Ⅲa表達量也無顯著增加[36-37]。纖維蛋白原可以通過GPⅡb-Ⅲa結合至復水化后的凍干血小板，但其親和力也僅相當于新鮮血小板的1/2[34,38]。

動物模型實驗已經證實了凍干血小板復水化后在體內具有一定的止血作用[39-40]。利用熒光標記示蹤法可定位凍干血小板復水化后在犬類血管損傷部位聚集并發揮促進血栓形成的作用[33]。37只活動性出血的犬類分別輸注新鮮血小板與凍干血小板治療，結果顯示二者對于犬類血小板的增量、存活率以及輸血不良反應發生情況均無顯著差異[41]。有報道指出，包括凍干血小板復水化后黏附完整的血管內皮細胞的能力大大降低[42]，且會在血液循環中由IgG介導的巨噬細胞吞噬下被迅速清除[43]。這提示盡管凍干血小板技術的研究取得了一定進展，但仍然存在四個方面難題需要攻破：凍干血小板保護劑和添加劑的選擇和優化；血小板凍干過程中凍干參數的設置和優化；血小板凍干后復水方式的研究；大容量凍干血小板技術的研發。

近年來國內外學者提出，在血小板凍干前預處理中通過負載海藻糖能夠有效提高血小板對滲透壓的耐受性，經過預處理的血小板經冷凍干燥并復水化后，其血小板恢復率高達80%；與新鮮血小板相比，具有相近的促血凝塊形成時間，最大聚集率以及聚集速率分別達新鮮血小板的80%和40%，且平均血小板體積有所增大，約40%的血小板細胞能表達P-選擇素以及GPⅡb-Ⅲa[44-45]。對于血小板的聚集功能仍然損傷較大，且凍干前一系列處理過程不可避免地會造成血小板的提前激活，導致血小板功能的降低甚至喪失。因此有學者開始在凍干血小板的預處理液中加入一些血小板抑制劑[46-48]，通過不斷地優化預處理液配方來最大程度減少血小板凍干前以及凍干過程中造成的損傷。

4 結語和展望

隨著醫療技術的不斷進步及臨床對血液制品需求的日益提高，血小板保存技術的難題已經成為限制臨床輸血救治工作的瓶頸，如何繼續深入開展血小板保存技術的研究，將已有的技術及時的轉化為臨床應用，并制定相應的技術規范與應用指南是我們廣大輸血醫學工作者值得思考并亟待解決的問題。室溫保存血小板在臨床預防性輸注中能夠顯著延長血小板的體內存活時間；4°C冷藏保存血小板在急性創傷性出血中能夠有效發揮止血作用；冷凍血小板能夠有效解決特殊表型血小板血液制品供應難題；凍干保存血小板能顯著提高我軍戰時及非戰爭軍事行動中的傷病員救治能力。充分認識到上述每項技術的獨特優勢并予以合理應用，同時針對性地加強血小板保存技術的深入研究，對于提高我國臨床輸血救治能力，我軍戰時及非戰爭軍事行動中的血液保障能力意義重大。