耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌耐藥機制的研究進展

任 艷，蔣文強

(綿陽市中心醫院檢驗科，四川 綿陽 621000)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)屬假單胞菌屬，革蘭陰性桿菌，是引起醫院感染的常見條件致病菌，常引起免疫力低下及ICU患者發生感染。根據中國CHINET細菌耐藥監測網的報告發現，2005年～2016年PA的臨床分離率均位于前列，是院內感染十分棘手的問題[1-3]。碳青霉烯類抗菌藥物是治療PA感染的有效藥物，但隨著該藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, CRPA)逐漸出現，給臨床治療帶來極大困難。2017年WHO將CRPA列為急需新藥開發以控制感染的三大細菌之一[4]。本文主要從外膜通透性降低、主動外排系統過表達、產生抗生素滅活酶以及生物膜形成方面對CRPA的主要耐藥機制做一綜述，以期為臨床合理用藥及新型抗感染藥物研發提供參考。

1 外膜通透性降低

PA屬于革蘭陰性菌，外膜作為PA細胞壁的主要成分，由磷脂和脂多糖(LPS)組成，內嵌有微孔蛋白(porins)?？股乜赏ㄟ^細菌外膜上的微孔蛋白進入菌體，若微孔蛋白的含量顯著減少或其結構發生改變，將導致抗生素無法進入細胞，從而形成耐藥。PA細胞膜的微孔蛋白可分為四類：①非特異性孔蛋白(non-specific porins)，可允許大多數分子量較小的親水性分子通過，如OprF；②特異性微孔蛋白(specific porins)，通過特異性位點結合特定的分子，如OprB、OprD、OprE、OprO及OprP；③門控蛋白(gated porins)，是一種可攝取離子復合物的離子調節外膜蛋白，如OprC和OprH；④外排泵孔蛋白(efflux porins)，是外排泵的重要組成部分，如OprM，OprN及OprJ[5]。其中，與碳青霉烯類耐藥有關的微孔蛋白主要有特異性孔蛋白OprD及外排泵蛋白。OprD又分為OprD1、OprD2和OprD3，其中OprD2含有碳青霉烯類抗生素的特異性結合位點，是碳青霉烯類藥物進入細胞的特異性通道。OprD2缺失或減少會使進入菌體的碳青霉烯類抗生素減少，從而使PA對該類抗生素產生耐藥[6]。袁翊等對70株CRPA菌株進行blaIMP、blaVIM、oprD2基因檢測，結果顯示blaIMP陽性30株，blaVIM陽性13株，OprD2缺失70株，缺失率100%[7]。黃志卓等對191株CRPA進行分析發現，OprD2基因缺失161株，缺失率63.4%[8]。Fang等對國內臨床分離的61株亞胺培南耐藥PA進行研究發現，其中50株存在框架突變或提前形成終止密碼子破壞OprD蛋白合成，5株OprD基因表達下降，剩下6株甚至未檢測到OprD基因表達[9]。而將OprD基因重組于OprD缺陷菌株外膜蛋白脂質體中，亞胺培南通透性可增加5倍以上，同時MIC也降低，細菌耐藥性也隨之消除[10]。另外，插入序列(insertion sequences, ISs)通過引起OprD基因序列改變進而影響OprD基因功能，從而導致細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥[11]。Bocharova等發現插入序列ISPa195可引起OprD基因結構發生改變，與外排泵系統過表達共同導致PA對亞胺培南、美羅培南耐藥[12]。由此可以看出，OprD蛋白減少或缺失在PA對碳青霉烯類抗生素耐藥中發揮重要作用。

2 主動外排系統過表達

細菌主動外排系統可將菌體內的有毒物質排出體外，是細菌耐藥的重要機制之一，可分為五大類：RND家族；MFS超家族；ABC超家族；SMR家族；MATE家族。其中，PA耐藥性相關外排系統均屬于RND家族，由內膜蛋白、外膜蛋白、膜融合蛋白組成[13]。內膜蛋白包括：MexB、MexD、MexF、MexY、MexK等，可識別藥物，并將其主動轉運出細胞膜；外膜蛋白包括：OprM、OprJ、OprN等，可形成門通道，具有孔蛋白的作用，使藥物排除至菌體外。融合蛋白包括：MexA、MexC、MexE、MexY等，連接內、外膜，與其共同構成主動外排系統，開口于外膜，使藥物直接泵出到菌體外。根據PA全基因組序列分析，推測該菌至少含有12種RND外排泵，其中4種(MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN及MexXY-OprM)與抗生素耐藥性相關[14]。Cavalcanti等發現MexAB-OprM和MexXY-OprM過表達可導致PA對碳青霉烯類抗生素耐藥[15]。Rostami等對19株碳青霉烯類抗生素高度耐藥PA進行mexB、mexY、ampC、OprD基因擴增，結果顯示12株呈mexB過表達，10株呈mexY過表達，7株ampC高表達，4株OprD低表達，其中7株mexB和mexY同時高表達，表明外排泵系統MexAB-OprM和MexXY-OprM在CRPA耐藥中具有重要作用[16]。

外排泵MexAB-OprM的MexA、MexB及OprM蛋白均由操縱子mexO編碼，而mexO又受到一系列調控基因(如mexR、nalC和nalD基因)的負向調控。mexR、nalC和nalD分別編碼mexO操縱子阻遏蛋白MexR、NalC和NalD；若調控基因發生突變，則對mexO負向調控作用減弱，從而上調外排泵MexAB-OprM表達。Pan等利用外排泵抑制劑MC2071190對國內75株CRPA進行外排泵表型研究，結果顯示13株表現為外排泵表型陽性[17]。通過PCR分析，其中10株檢測出mexB和mexR、nalC及nalD。對PCR擴增產物進行測序分析，9株在NalC第71位氨基酸發生突變(甘氨酸→谷氨酸)，8株在NalC第209位發生突變(絲氨酸→精氨酸)，1株在NalD第158位氨基酸發生突變(蘇氨酸→異亮氨酸)，8株在MexR蛋白上發生突變。由此可見，MexAB-OprM過表達在CRPA中扮演重要作用，而調控基因突變可能是MexAB-OprM過表達的主要因素。另外，有研究發現，MexAB-OprM外排泵對多數抗生素均發揮一定作用，若出現過表達現象，將會使美羅培南的MIC明顯增高，但對亞胺培南的敏感性不會產生明顯影響[18]。外排泵系統常引起中等程度耐藥，但它們常常與其他耐藥機制共同作用引起高水平耐藥，從而增加PA治療的復雜性。

3 產生抗菌藥物滅活酶

CRPA產生的藥物滅活酶主要是指碳青霉烯酶。碳青霉烯酶是一種可以將碳青霉烯類抗生素滅活的β-內酰胺酶，主要分布于β-內酰胺酶的A、B、D類中。據氨基酸序列的不同，β-內酰胺酶可分為四類，即A、B、C和D類。A、C和D類酶均含有絲氨酸活性位點；而B類酶屬于金屬β-內酰胺酶(metallo-β-lactamasesm, MBL)，其發生作用需要鋅離子參與，是CRPA的主要β-內酰胺酶，可由整合子或質粒介導[19]。A類酶包括KPC、SME、NMC、GES；B類酶主要包括IMP、VIM、SPM、GIM、SIM和NDM。C類酶主要指AmpC酶；D類酶包括OXA型酶。PA菌株中主要的碳青霉烯酶是MBLs，包括IMP、VIM、NDM、SPM和GIM 5種類型。IMP和VIM是MBLs中最常見的酶類，含有多種亞型，在眾多亞型中，VIM-2型占主導地位；而NDM、SPM和GIM則只含有一種亞型，即NDM-1、SPM-1、GIM-1[20]。Rostami等對從燒傷病人分離的CRPA的主要耐藥機制進行研究，發現15株(17.9%)呈blaIMP基因陽性，1(1.2%)株呈blaVIM陽性，未檢測出blaSPM和blaNDM基因[16]。曾為倫等發現，60株CRPA菌株中，IMP陽性32株，VIM陽性16株，IMP和VIM同時陽性12株，表明該地區CRPA耐藥機制以產碳青霉烯酶IMP、VIM為主[21]。劉洋等對24株CRPA進行碳青霉烯酶基因檢測發現，其中11株攜帶VIM-2酶基因blaVIM-2，2株攜帶KPC-2酶基因blaKPC-2，未檢測出blaIMP、blaNDM、blaOXA-48等其他基因型[22]。并且進一步分析顯示，13株碳青霉烯酶陽性菌株中12株攜帶1種或2種質粒介導喹諾酮類耐藥(PMQR)基因，表明碳青霉烯酶基因和PMQR基因存在一定的“共傳播”現象，共同導致細菌多重耐藥。產KPC或NDM型碳青霉烯酶CRPA比較少見，但有研究表明KPC酶是MBL陰性PA耐碳青霉烯類抗生素的主要原因之一[15]，因此仍需引起重視。

MBL編碼基因位大多位于質粒、轉座子或Ⅰ類整合子上，通過質粒、轉座子和整合子的作用使耐藥性在細菌間傳播。Karampatakis 等發現blaVIM基因亞型以基因盒的形式位于Ⅰ類整合子不同位置上并可在細菌之間進行傳播[23]。van der Zee等通過研究發現，碳青霉烯類抗生素耐藥的多重耐藥PA中存在一種復合轉座子，該轉座子攜帶含有blaVIM-2基因的Ⅰ類整合子，可在染色體和接合質粒間進行轉位，并通過此種方式將耐藥基因傳播給其他PA菌株[24]。

4 生物膜形成

細菌生物膜(Bacterial biofilm, BF)是指附著于有生命或無生命物體表面相互聚集而形成的微菌落聚合物，由細菌和自身分泌的胞外基質組成。胞外基質包括胞外多糖、脂類、蛋白質、代謝產物和胞外DNA(eDNA)等，可介導細菌之間進行黏附，并組成生物膜的基本結構。當PA形成生物膜后，分泌的胞外多糖形成一種滲透屏障，阻礙了抗生素擴散至菌體內，從而增強其耐藥性，并且容易導致感染轉為慢性，遷延不愈[25]。這些滲透屏障使得生物膜內營養不足而導致細菌生長緩慢、代謝不活躍，進而增加持留菌(persister cells)的形成[26]。持留菌占生物膜細菌的1%左右，生長緩慢，代謝不活躍并且高度耐受抗生素[27]。一定濃度的抗生素能殺死大多數PA，持留菌因其細胞處于休眠狀態，代謝緩慢，抗生素結合靶點合成減少等原因并不會被抗生素殺死，并能重新形成生物膜[28]。Maisonneuve等研究發現，在抗生素存在的條件下，持留菌并不會增殖；一旦去除抗生素，則可恢復生長[29]。因此，生物膜中的持留菌是導致慢性感染遷延難治的主要因素。研究發現從肺囊性纖維化病人中分離出的PA更易形成持留菌，這些持留菌高度耐受抗生素并且很可能發展成為多重耐藥菌[30]。

近年來，隨著醫用高分子材料及病房各種置管操作的增多，使得生物膜PA在肺部囊性纖維化、尿路感染等患者及醫療器械、導管上分離較多[31]。PA通過自身分泌的DNA、蛋白及胞外多糖在肺上皮細胞表面形成生物膜，從而引起肺囊性纖維化患者發生慢性感染，并可耐受強化抗生素治療且不受宿主炎性反應的影響[32]。張艷芳等對亞胺培南耐藥型和敏感型PA的生物膜形成能力進行研究發現，耐藥型PA的生物膜形成能力較敏感型PA更強[33]，說明生物膜在PA對碳青霉烯類藥物耐藥中具有一定作用。Rossi Gon?alves等采用定量檢測總生物量的方式對5株MBL陽性PA菌株(2株SPM-1陽性，1株VIM陽性，2株MBL表型陽性)的生物膜形成能力進行研究，結果顯示所有菌株具有強生物膜形成能力[34]，進一步顯示生物膜在PA對碳青霉烯類抗生素耐藥中發揮一定作用。

PA生物膜形成的調節是多方面的，主要依賴于群體感應系統、細菌雙組份調節系統(two-component regulatory systems, TCS)——GacS/GacA和RetS/LadS、胞外多糖及c-di-GMP信號通路[35]。細菌通過特定信號分子的濃度變化可以監測周圍環境中自身或其他細菌的數量變化，當信號分子達到一定的濃度閾值時，能啟動菌體中相關基因的表達來適應環境中的變化，這種依賴細胞密度的細胞信息交流現象被稱為細菌群體效應(quorum-sensing, QS)。通過對細菌QS系統的研究發現，QS參與多種細菌生物學功能的調控，控制著病原菌的致病性(如胞外酶的產生、毒力因子的表達等)和某些細菌生物膜的形成。PA含有3種主要的QS系統，分別是LasI-LasR、RhlI-RhlR和PQS-MvfR，均參與生物膜的形成。Davis等對PA生物膜的形成進行研究發現，當細菌QS作用受到抑制時，所形成的生物膜較薄，沒有正常成熟的生物膜結構，并對生物滅菌劑十二烷基磺酸鈉(SDS)的抵抗力顯著下降；但在培養基中加入QS所需要的信號分子后，PA就能形成正常的生物膜[36]。通過QS信號系統可以控制并協調整個細菌群體行為，共同對周圍環境刺激做出反應，極大增強了整個細菌群體的生存能力。

研究發現，GacA缺失PA菌株對生物膜形成能力的作用較野生型下降10倍左右，表明GacS/GacA系統在生物膜形成中具有正向調節作用[37]。相反的，RetS/LadS系統中的傳感激酶RetS則抑制PA生物膜的形成[38]。PA產生的胞外多糖包含藻酸鹽、Pel和Psl，起穩定生物膜結構的功能。另外，細菌裂解后釋放出的eDNA作為生物膜基質的另一重要成分可促進菌體在表面進行黏附、聚集[39]。c-di-GMP是一種胞內小分子，在細菌信號傳導中發揮第二信使的作用，c-di-GMP高表達與生物膜形成相關。另外，c-di-GMP還可通過調節細菌黏附作用及胞外多糖的產生，參與PA生物膜的形成[40]。細菌群體效應及c-di-GMP信號通路在PA生物膜形成過程中發揮重要調節作用，通過靶向抑制這些通路中的致病因子可作為研發抗生物膜形成藥物的有效途徑。

5 小結

PA作為一種條件致病菌嚴重威脅著人類健康，CRPA的出現給臨床治療帶來極大的困難和挑戰。外膜通透性降低、外排泵高表達、抗生素滅活酶的產生及生物膜的形成在PA耐藥形成過程中發揮重要作用。CRPA的形成并不僅僅是由單一的機制介導，也是不同耐藥機制共同作用的結果。因此，了解PA耐藥機制對于臨床合理使用抗生素，加強醫院對PA的監測，防止多重耐藥菌株水平傳播，控制耐藥菌株的出現具有重要意義。