SPINK1、G9a在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的評(píng)估價(jià)值

王宗艷，段 莎

胃癌是我國(guó)常發(fā)的消化道惡性腫瘤之一[1]，該疾病早期起病隱匿，且無明顯的臨床癥狀。由于該疾病發(fā)生局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時(shí)間早，當(dāng)患者被確診時(shí)已錯(cuò)過最佳治療時(shí)間，導(dǎo)致胃癌成為預(yù)后差、病死率較高的疾病之一[2-3]。近年來，隨著臨床檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)已經(jīng)成為預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生、診斷以及監(jiān)測(cè)或評(píng)估患者治療效果的有效參考標(biāo)準(zhǔn)[4]。絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型(serine peptidase inhibitor Kazal type 1， SPINK1)基因位于5號(hào)染色體[5]，在胰腺癌的研究中顯示，SPINK1的異常高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)[6]，提示其有可能在胃癌組織中也存在異常高表達(dá)現(xiàn)象并參與調(diào)控腫瘤的發(fā)展及預(yù)后。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a能夠?qū)⒓谆鶑募琢虬彼徂D(zhuǎn)移到賴氨酸殘基上[7]，而DNA的甲基化過程往往與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，同時(shí)有研究指出G9a蛋白在多種腫瘤中存在高表達(dá)現(xiàn)象[8]。但目前關(guān)于SPINK1和G9a在胃癌中的表達(dá)及對(duì)胃癌患者預(yù)后的研究報(bào)道較少，因此本研究以胃癌患者為研究對(duì)象，探討胃癌患者癌組織中SPINK1和G9a的表達(dá)水平與患者臨床病理分級(jí)及對(duì)患者預(yù)后的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2012年1月—2015年6月我院經(jīng)病理學(xué)檢查確診的112例胃癌，男57例，女55例；年齡38～75(55.47±2.18)歲，其中年齡≤60歲62例，年齡>60歲50例；胃癌部位：胃底賁門癌45例，胃體癌33例，胃竇癌34例；腫瘤分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期33例，Ⅲ期28例，Ⅳ期22例；分化程度：高分化42例，低分化70例；其中淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移患者55例；浸潤(rùn)深度T1期為27例，T2期為31例，T3期為26例，T4期為28例。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)首次確診為胃癌患者；入院治療前未接受放療、化療、靶向藥物等治療；患者同意接受胃癌手術(shù)治療；臨床資料完整，治療依從性良好；身體狀況相對(duì)良好，能夠耐受手術(shù)治療，預(yù)計(jì)存活期>1年；患者熟知本課題研究方案自愿參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者存在明顯的腫瘤轉(zhuǎn)移；合并有其他器官功能異常及嚴(yán)重心血管疾病；合并有其他腫瘤；存在用藥過敏、治療不耐受或禁忌證的患者。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過后展開實(shí)施。

1.3材料與方法

1.3.1試劑及儀器：兔抗人SPINK1抗體購自美國(guó)Proteintech Group公司，貨號(hào)：Ag7931；鼠抗人G9a/EHMT2抗體購自Proteintech Group公司，貨號(hào)：66689-1-Ig；圖像采集成像系統(tǒng)(chemiDocTm)及圖像分析系統(tǒng)(Quantity One 1-D分析軟件)購自美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司。

1.3.2免疫組化：將患者進(jìn)行病理學(xué)診斷時(shí)獲得的病理組織由石蠟包埋后連續(xù)切片，固定于載玻片上，50℃烘箱中烘1 h后，依次選用二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇及75%乙醇進(jìn)行水化，蒸餾水洗滌3次，然后置于枸櫞酸鈉溶液中加熱2次，每次8 min，PBS洗滌3次，3% H2O2溶液中浸10 min，PBS洗滌3次后，滴加SPINK1抗體和G9a抗體稀釋液，4℃孵育過夜。PBS洗滌3次后用羊抗兔二抗室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染2 min，0.1% HCl分化，藍(lán)化，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.3數(shù)據(jù)對(duì)比分析：免疫組化結(jié)果評(píng)估由兩名專業(yè)病理人員采用雙盲法進(jìn)行判定，每張組織切片高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野區(qū)，獨(dú)立進(jìn)行半定量積分的判斷，結(jié)果一致則記錄結(jié)果；不一致則由2人統(tǒng)一意見或第3位更加權(quán)威的醫(yī)師確定。顯微鏡下觀察組織細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為顯色。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：按染色面積分為染色細(xì)胞比例<5%記0分；染色細(xì)胞比例5%～30%記1分；染色細(xì)胞比例為31%～75%記2分；染色細(xì)胞比例>75%記3分。依照染色深淺分為：無染色為0分，微弱染色為1分，中度染色為2分，強(qiáng)染色為3分。最終得分=染色面積得分×染色深淺得分，單種蛋白最終得分>4分定義為陽性高表達(dá)；2種蛋白染色最終得分均>4分定義為共高表達(dá)患者。

1.3.4隨訪及信息統(tǒng)計(jì)：所有患者以門診、住院復(fù)查的方式由主治醫(yī)師定期隨訪，隨訪內(nèi)容包括患者治療方案、復(fù)查信息、胃部X線氣鋇雙重造影、胃鏡檢查、生存、復(fù)發(fā)等。時(shí)間起始于患者入院治療，隨訪3年，統(tǒng)計(jì)患者生存、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況。

2 結(jié)果

2.1胃癌組織及癌旁正常組織中SPINK1和G9a的表達(dá) SPINK1和G9a在胃癌組織中的陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1和圖1。

表1 112例胃癌組織和癌旁正常組織中SPINK1、G9a的表達(dá)情況[例(%)]

注：SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶；與癌旁組織比較，bP<0.01

2.2胃癌組織中SPINK1、G9a表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組織中SPINK1、G9a表達(dá)與浸潤(rùn)分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡、性別、分化程度及腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)。見表2。

圖1 SPINK1和G9a在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況(DAB×40)

SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶

表2 SPINK1、G9a陽性表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

注：SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶；bP<0.01

2.3胃癌組織中SPINK1和G9a表達(dá)相關(guān)性 胃癌組織中SPINK1和G9a表達(dá)情況呈正相關(guān)(r=0.831,P<0.05)。見表3。

表3 112例胃癌組織中SPINK1、G9a表達(dá)相關(guān)性(例)

注：SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶

2.4胃癌組織中SPINK1和G9a高表達(dá)與患者生存期的關(guān)系 SPINK1和G9a高表達(dá)者3年存活率分別低于SPINK1和G9a低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 112例胃癌組織SPINK1和G9a高表達(dá)與患者生存期的關(guān)系(%)

注:SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶；與低表達(dá)者比較，bP<0.01

2.5SPINK1與G9a共表達(dá)與胃癌預(yù)后分析 SPINK1、G9a蛋白共高表達(dá)組患者術(shù)后中位生存時(shí)間、無病生存率、總生存率均低于SPINK1、G9a蛋白共低表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表5、圖2。

3 討論

絲氨酸蛋白酶抑制劑是目前研究發(fā)現(xiàn)分布、規(guī)模最大的蛋白酶抑制劑家族，已確認(rèn)的種類超過1500種[9]，其中Kazal1型(SPINK1)最早由胰腺分泌獲得，其主要功能是抑制蛋白酶活性。近年來隨著對(duì)腫瘤標(biāo)志物的研究發(fā)現(xiàn)，SPINK1蛋白結(jié)構(gòu)與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)類似[6]，能夠通過MAPK信號(hào)通路，磷酸化EGF受體蛋白刺激細(xì)胞的生長(zhǎng)，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮自分泌生長(zhǎng)因子的作用[10]。同時(shí)腫瘤會(huì)引起患者血液中SPINK1水平升高，在對(duì)癌癥患者的同種器官組織研究發(fā)現(xiàn)，在正常組織中SPINK1表達(dá)水平較低，但在腫瘤組織中存在明顯的高表達(dá)現(xiàn)象[11]，提示SPINK1蛋白的表達(dá)水平可以作為預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生的標(biāo)志物。

組蛋白轉(zhuǎn)移酶能夠以s-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，進(jìn)行甲基轉(zhuǎn)移[12]，其中G9a是指組蛋白第9位甲基轉(zhuǎn)移酶[13]，由于G9a的甲基化參與染色質(zhì)的形成、DNA修飾及基因的轉(zhuǎn)錄與沉默，而腫瘤的發(fā)生被認(rèn)為是遺傳基因的改變引起的一類疾病，大量臨床研究顯示組蛋白進(jìn)行的表觀遺傳異常修飾，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14]。在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中均能發(fā)現(xiàn)大量表觀遺傳修飾異常細(xì)胞的存在，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)均存在明顯的G9a高表達(dá)現(xiàn)象[15-16]，表明G9a可能在腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮積極作用。

表5 SPINK1與G9a共表達(dá)與胃癌預(yù)后分析

注：SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶；與SPINK1、G9a蛋白共低表達(dá)比較，aP<0.01，bP<0.01

圖2 SPINK1與G9a共表達(dá)水平與患者生存曲線分析

SPINK1為絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型，G9a為組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶

本研究結(jié)果顯示，SPINK1、G9a在腫瘤組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，與Zhang等[17]、李厚雷等[18]研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，胃癌組織中SPINK1和G9a的表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者年齡、性別、分化程度、腫瘤部位無關(guān)。有研究指出SPINK1可能通過作用表皮生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力[19]，而沉默腫瘤細(xì)胞G9a的表達(dá)能夠顯著降低腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力[20]，提示檢測(cè)患者腫瘤組織中SPINK1、G9a的表達(dá)水平可反映疾病發(fā)展程度。本研究對(duì)兩種蛋白的表達(dá)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，SPINK1與G9a表達(dá)存在顯著的共表達(dá)現(xiàn)象，SPINK1與G9a高表達(dá)患者的3年存活率均顯著低于共低表達(dá)患者。同時(shí)對(duì)SPINK1與G9a共高表達(dá)3年的預(yù)后情況分析發(fā)現(xiàn)，共高表達(dá)患者的中位生存時(shí)間、無病生存率、總生存率均低于共低表達(dá)患者，其原因可能是由于兩種蛋白的高表達(dá)水平往往預(yù)示著腫瘤細(xì)胞處于增殖旺盛期，患者存在較高風(fēng)險(xiǎn)的腫瘤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者治療難度大，不利于患者的預(yù)后和長(zhǎng)期生存[21-22]。

綜上所述，胃癌組織中SPINK1、G9a的高水平表達(dá)與胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。有研究指出腫瘤患者的血液和尿液中與正常人相比也會(huì)存在SPINK1與G9a高表達(dá)現(xiàn)象，與本研究免疫組化染色相比，樣本獲取及檢測(cè)更為簡(jiǎn)潔，因此在后續(xù)的研究中，將主要探究患者血清或其他體液中SPINK1、G9a的表達(dá)水平與胃癌患者疾病發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。