模擬微重力對HaCaT細胞創傷修復相關蛋白和基因表達的影響

林晶晶,孫培鳴,張 濤,徐冰心,段育忠,周金蓮,楊鶴鳴,李成林,崔 彥

隨著載人航天事業的迅猛發展，失重影響航天員健康的問題受到廣泛關注。航天實踐和研究證明，失重環境會導致機體各系統器官產生一系列病理生理變化[1-2]。NASA研究指出，創傷是失重環境中影響航天員身心健康及任務執行能力的最大威脅，應給予最高等級的關注[3]。研究失重環境對創傷及其修復過程的影響具有重要而深遠的意義[4]。在皮膚創面愈合過程中，角質細胞是創傷修復的重要細胞，其分泌的相關蛋白和細胞因子參與調節創傷修復進程[5]。本實驗釆用微重力細胞培養系統(the rotary cell culture system， RCCS)研究模擬失重對人永生化角質形成細胞(HaCaT)創傷修復蛋白表達及超微結構的影響，為航天醫學實踐中的醫監醫保工作提供理論參考。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 HaCaT細胞株(北京協和細胞資源中心)，微載體Cytodex-3(GEHealthcare， USA)，RCCS(Synthecon， USA)，10 ml高截面縱橫比容器(high aspect ratio vessel， HARV， Synthecon， USA)，透射電鏡(Tecnai Spirit， USA)，小鼠抗人熱休克蛋白70(HSP70)單克隆抗體，兔抗人基質金屬白酶-9(MMP-9)單克隆抗體，小鼠抗人凋亡蛋白Caspase-3單克隆抗體。

1.2HaCaT細胞株培養擴增和實驗分組 HaCaT細胞株以含10%胎牛血清及雙抗(100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)的DMEM高糖培養基，于37℃ CO2培養箱中培養，待細胞融合度達到80%左右進行傳代。將HaCaT細胞隨機分為模擬微重力(simulated microgravity group， SMG)組和正常重力對照(normal gravity group， NG)組，SMG組HaCaT細胞與微載體共同置入HARV在RCCS中培養。NG組HaCaT細胞置于培養瓶中正常培養。

1.3建立RCCS微載體培養體系 將準備好的Cytodex-3微載體置入HARV,加入含10%胎牛血清的DMEM培養基。將培養好的HaCaT細胞以2×106密度接種于HARV，加滿上述培養基，用5 ml注射器排氣泡后放入RCCS。RCCS中初始轉速設置為12 r/min，12 h后設為14 r/min，之后密切觀察，依培養狀態調整轉速，使微載體能懸浮在培養液中，根據預實驗HaCaT細胞對數生長期生長曲線和倍增時間，設定培養時間分別為32、36、42 h。

1.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測 HSP70、MMP-9和Caspase-3 mRNA表達水平檢測主要步驟如下：收集2組培養32、36、42 h細胞，提取總RNA逆轉錄反應合成cDNA，將cDNA樣品稀釋8倍作為模板上機檢測，分析2組基因表達情況，根據文獻設計PCR引物。PCR引物由上海生工股份有限公司合成，見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列表

注：PCR為聚合酶鏈反應，HSP70為熱休克蛋白70，MMP-9為基質金屬蛋白酶-9，Caspase-3為凋亡蛋白

1.5蛋白免疫印跡法分析 收集2組培養32、36、42 h細胞，用預冷的PBS洗3遍，加400 μl裂解液于冰上裂解30 min，收集細胞碎片和裂解液，12 000 r/min離心30 min，轉移上清。測定蛋白濃度后進行SDS-PAGE電泳及轉膜、封閉。加入一抗4℃孵育過夜(≥18 h)，TBST洗滌3遍，加入二抗室溫搖床孵育2 h。TBST洗膜3遍后加入二氨基聯苯胺(DAB)顯色。

1.6透射電鏡 RCCS培育42 h后，吸出HARV中混合液體于15 ml離心管中，靜置5 min棄上清，PBS洗滌2遍，每個樣本加0.25%胰酶消化液2～3 ml，37℃消化10 min后，再以1000 r/min的轉速離心5 min。加入含血清培養基終止消化作用，輕輕吹打，使細胞從微載體上脫落，70 μm細胞篩過濾，獲得單細胞懸液后再次RCCS培育42 h，吸出HARV中混合液體于15 ml離心管中，靜置5 min，棄上清，PBS洗滌2遍，每個樣本加0. 25%胰酶消化液2～3 ml，37℃消化10 min，1000 r/min離心5 min。加入含血清培養基終止消化作用，輕輕吹打，使細胞從微載體上脫落，再通過70 μm細胞篩過濾，獲得單細胞懸液后離心沉淀細胞團。NG組細胞按正常消化步驟，將離心后細胞團分別收集到1.5 ml EP管中。按順序用2.5%戊二醛和1%鋨酸室溫下固定2 h，乙醇梯度脫水，用Epon 812純樹脂包埋并切片，透射電鏡下觀察細胞超微結構并照相。

2 結果

2.1RT-PCR檢測結果 SMG組HaCaT細胞培養32、36 h HSP70 mRNA表達水平，培養32、36和42 h MMP-9 mRNA及培養36 h Caspase-3 mRNA表達水平均高于NG組(P<0.05)。見表2。

表2 2組HaCaT細胞經不同時間培養后創傷修復相關基因相對表達量

注：SMG組為模擬微重力組，NG組為正常重力對照組；HSP70為熱休克蛋白70，MMP-9為基質金屬蛋白酶-9，Caspase-3為凋亡蛋白；與NG組比較，aP<0.05

2.2蛋白免疫印跡檢測結果 以目標檢測蛋白與相應內參β-actin蛋白條帶的吸光度值的比值(HSP70/β-actin、MMP-9/β-actin和Caspase-3/β-actin)代表該蛋白的相對表達量。SMG組細胞培養32、36和42 h后HSP70和MMP-9蛋白表達趨勢與相應蛋白mRNA表達一致，而Caspase-3蛋白表達趨勢與相應mRNA存在一定差異。見圖1。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測相關蛋白的表達變化

1～6分別代表SMG組32 h、NG組32 h、SMG組36 h、NG組36 h、SMG組42 h、NG組42 h對應蛋白的電泳條帶；SMG組為模擬微重力組，NG組為正常重力對照組；HSP70為熱休克蛋白70，MMP-9為基質金屬蛋白酶-9，Caspase-3為凋亡蛋白

2.3細胞超微結構 NG組細胞形態規則，胞膜、核膜結構完整，線粒體嵴清晰可見。SMG組為模擬微重力環境下培養42 h后的HaCaT細胞，可見細胞有皺縮表現，細胞器較難辨認，胞漿內存在較多空泡，細胞核形態不規則，核內有染色質凝結現象，細胞線粒體嵴出現斷裂，結構模糊，部分線粒體出現空泡。見圖2。

圖2 模擬微重力條件下HaCaT細胞超微結構變化

A.NG組42 h, 2 μm;B.NG組42 h, 1 μm; C.SMG組42 h, 2 μm;D.SMG組42 h, 1 μm；SMG組為模擬微重力組，NG組為正常重力對照組;HaCaT為人永生化角質形成細胞

3 討論

航天飛行過程中最常見的創傷為皮膚軟組織傷[3]。研究發現，失重會引起肢體血流灌注水平改變，進而影響傷口的愈合[6]。Radek等[7]通過尾懸吊動物模型的皮膚打孔實驗，發現模擬失重條件下大鼠傷口愈合明顯延遲。本課題組前期研究表明，失重會影響成纖維細胞的生長增殖、細胞結構、相關基因和蛋白的表達[8-10]。從現有文獻報道看，航天飛行過程中最容易發生的皮膚軟組織創傷的基礎和應用研究均比較局限，亟待系統深入研究[4]。本實驗采用RCCS模擬微重力環境進行細胞實驗，其原理是培養物在HARV中隨RCCS旋轉產生運動，通過獨特的流體力學與低剪應力效應，促進細胞與細胞間的相互作用，增加細胞結合的自由度，該流體環境可使其中的懸浮細胞處于失重狀態，從而可在地基條件下模擬地球附近空間的失重情況，成為研究地面模擬組織細胞微重力效應的一種理想方法[11]。

皮膚創面修愈過程中發揮關鍵作用的細胞包括角質細胞、成纖維細胞及內皮細胞。角質形成細胞是表皮的重要組成細胞之一，也是皮膚更新、屏障形成和免疫防御的主要細胞，其增殖、分化和遷移是纖維增生、新血管形成和創面愈合的生理基礎[5]。HaCaT細胞來源于人的表皮細胞，與角質形成細胞的基本特性極其相似。本研究前期實驗證實，模擬微重力環境對人角質細胞產生的一系列影響，包括抑制角質細胞增殖及細胞因子的分泌，影響角質細胞微絲和骨架結構[12]。

HSPs是一種高度保守的分子伴侶蛋白，在原核細胞與真核細胞中廣泛存在。在人皮膚中，HSPs最主要的來源是角質細胞。機體細胞受到理化因素刺激后，HSPs從低表達狀態轉入高表達狀態，故又被稱為應激蛋白。HSPs在細胞正常生長發育及蛋白代謝中具有重要作用；在應激條件下，HSPs則具有細胞保護作用[13-14]。本研究結果顯示，SMG組HaCaT細胞的HSP70 mRNA及蛋白表達水平高于NG組。分析原因為，作為皮膚中HSPs最主要的來源，HaCaT細胞對失重環境這一特殊刺激因素通過提升HSPs表達等機制而發生應激效應，在造成應激損傷的同時，提升在特殊環境中的生存和適應能力。有學者研究發現，在失重環境下，內皮細胞、骨干細胞、肝細胞等的HSP70表達上調，顯然，HSPs在機體多種組織器官的失重應激過程中發揮作用[15-17]。長期以來一直認為，HSPs作為分子伴侶維護蛋白質正常構象，調整蛋白質折疊、裝配、轉運和降解，并參與應激狀態下的細胞保護。如何在創傷愈合中合理誘導或抑制HSPs生成，有效利用其雙刃劍樣作用，做到趨利避害、酌情把控、精準調節，這些技術性的問題尚有待解決[18]。HSP70在失重環境下皮膚創傷及愈合過程中的作用和機制以及潛在的治療價值，尚有待進一步研究。

本研究結果顯示，SMG組HaCaT細胞MMP-9 mRNA及蛋白表達量高于NG組。據文獻報道，在失重環境下志愿者口腔牙裂液、大鼠頸總動脈及獼猴肺組織中MMP亦發生顯著變化[19-21]。MMPs是一組破壞細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的鋅和鈣依賴性蛋白溶解酶，在正常細胞中為低表達狀態，受到刺激后表達量增加。在創面愈合過程中，皮膚角質細胞、成纖維細胞和炎性細胞亦分泌MMPs而發揮調控作用[22]。MMP-9能降解幾乎所有的ECM蛋白，其表達水平增高反映了細胞損傷的因素和程度；但同時MMP-9也是重要的創傷修復蛋白，其在創面重塑過程中發揮重要作用[23-24]。分析認為，在失重環境中HaCaT細胞分泌MMP-9增多，早期參與失重應激損傷反應，后期可能介導耐受適應修復。

本研究還發現，SMG組HaCaT細胞Caspase-3表達量僅培養36 h時高于NG組，同時，透射電鏡觀察結果顯示，模擬微重力條件下培養的HaCaT細胞超微結構發生線粒體損傷等病理變化。本課題組前期研究亦表明，微重力環境對HaCaT細胞的微絲骨架結構可造成明顯影響，破壞了細胞微絲結構的有序性，與生長增殖及自分泌功能受損等共同構成了HaCaT細胞失重應激損傷的生理病理表現[12]。Caspase-3是經典的凋亡蛋白，是重要的細胞凋亡激活蛋白之一，眾多因素可通過該通路引發細胞凋亡[25]。顯然，失重作為一種特殊因素可通過Caspase途徑誘發HaCaT細胞凋亡?？紤]到HSP的抗凋亡及細胞保護作用對細胞凋亡進程會產生一定影響，分析與Caspase-3 mRNA及蛋白表達有一定關系，具體有待深入探討。

綜上所述，失重影響航天員健康的問題已引起廣泛關注，創傷是失重環境中影響航天員身心健康及任務執行能力的最大威脅。微重力環境下HaCaT細胞HSP70、MMP-9及Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平變化以及細胞超微結構病理性改變均提示失重可導致皮膚角質細胞發生應激損傷和細胞凋亡以及一定程度的適應特征。