結(jié)腸鏡活檢組織DKK3基因甲基化檢測(cè)及其臨床價(jià)值

周陽(yáng)貞

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北省襄陽(yáng)市 441000

DKK3基因具有拮抗Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路功能，可調(diào)控細(xì)胞增殖分化，目前研究發(fā)現(xiàn)DKK3甲基化與多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，可作為其病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物，較傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)記物具有更高的靈敏度及特異性[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌腫瘤組織中的DKK3表達(dá)顯著降低[3]，基于基因表達(dá)法則推測(cè)在結(jié)腸癌中DKK3甲基化表達(dá)可能處于沉默狀態(tài)。故以本科結(jié)腸癌患者為研究對(duì)象，取其結(jié)腸鏡活檢組織，評(píng)價(jià)DKK3甲基化在其病情及預(yù)后評(píng)價(jià)中的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2011年1—12月于本科診治的結(jié)腸癌患者納入本研究(COC組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)和(或)結(jié)腸鏡檢查、血清CEA和CA199、盆腹腔增強(qiáng)CT確診為結(jié)腸癌；(2)預(yù)計(jì)生存≥3個(gè)月，KPS評(píng)分≥70分；(3)首次發(fā)現(xiàn)，未行治療，無(wú)結(jié)腸癌病史；(4)排除合并嚴(yán)重心、腦、肺疾病及其他腫瘤。將同期行結(jié)腸鏡檢查的正常人納入對(duì)照組(CON組)，兩組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 DKK3甲基化檢測(cè) 兩組均行結(jié)腸鏡檢查，COC組結(jié)腸癌患者取腫瘤組織，CON組正常人取正常組織，提取兩組研究組織基因DNA待后續(xù)檢測(cè)。取兩組結(jié)腸鏡活檢組織，以MSP法檢測(cè)DKK3甲基化，引物選擇ABI Methyl primer Express設(shè)計(jì)，表2為其引物序列。擴(kuò)增循環(huán)條件：5min 95℃預(yù)變性，30s 95℃變性，30s 58℃退火，40s 72℃延伸，共行32個(gè)循環(huán)，循環(huán)最后一輪行5min 72℃延伸5min。

表2 MSP法檢測(cè)DKK3甲基化引物

2 結(jié)果

2.1 DKK3甲基化比較 COC組結(jié)腸鏡活檢組織DKK3甲基化45例，甲基化率為60.0%(45/75)，CON組結(jié)腸鏡活檢組織DKK3甲基化0例，甲基化率為0%，COC組結(jié)腸癌患者結(jié)腸鏡活檢組織DKK3甲基化率較CON組高(P<0.05)。

2.2 COC組發(fā)生DKK3甲基化相關(guān)性 在年齡、性別、出血、梗阻、病變部位、COC組病理類(lèi)型與DKK3甲基化無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。在腫瘤最大徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Dukes分期和手術(shù)切除方面與DKK3甲基化均有相關(guān)性(均P<0.05)。姑息性手術(shù)、C+D期、腫瘤最大徑≥5cm、低+中分化、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者DKK3甲基化率高于根治性手術(shù)、A+B期、腫瘤最大徑<5cm、高分化、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(均P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 COC組臨床病理與DKK3甲基化關(guān)系

2.3 DKK3甲基化與預(yù)后關(guān)系 45,15 DKK3甲基化患者R0切除率、5年生存率及總生存時(shí)間均低于未甲基化患者(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 DKK3甲基化與未甲基化結(jié)腸癌患者預(yù)后對(duì)比

3 討論

越來(lái)越多的研究證實(shí)結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸與表觀遺傳學(xué)關(guān)系密切。其中，盡管異常甲基化并不依賴DNA堿基序列改變，但其仍然是結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制及表觀遺傳學(xué)中的最常見(jiàn)發(fā)病因素。5’甲基化mCpG結(jié)構(gòu)單獨(dú)或與甲基結(jié)合蛋白結(jié)合后可阻止啟動(dòng)子結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子干預(yù)RNA轉(zhuǎn)錄，致使基因表達(dá)沉默[4-5]。作為調(diào)控細(xì)胞增殖分化的信號(hào)通路，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路異常激活可導(dǎo)致胞漿內(nèi)變異β-catenin蛋白大量積聚于細(xì)胞核內(nèi)，加快靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖。研究證明，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路在多種腫瘤中異常存在，且與其病情及預(yù)后緊密相關(guān)[6-7]。DKK3為Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路拮抗因子，可拮抗Wnt與其受體結(jié)合后的復(fù)合物而抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路，DKK3表達(dá)升高可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，降低則喪失調(diào)控功能導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生[8]。目前，DKK3功能異常的機(jī)制尚未完全明確，越來(lái)越多的研究證實(shí)DKK3存在甲基化調(diào)控的CpG島，為DKK3表觀遺傳學(xué)調(diào)控提供客觀基礎(chǔ)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DKK3啟動(dòng)子甲基化異常是其基因表達(dá)異常的最常見(jiàn)機(jī)制，在越來(lái)越多的腫瘤中發(fā)現(xiàn)DKK3啟動(dòng)子處于高甲基化狀態(tài)，且與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后好壞密切相關(guān)[9-10]。基于目前發(fā)現(xiàn)，判斷結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制及預(yù)后與DKK3啟動(dòng)子甲基化密切相關(guān)。本研究中，COC組結(jié)腸癌患者結(jié)腸鏡活檢組織DKK3甲基化45例，甲基化率為60.0%，CON組正常人結(jié)腸鏡活檢組織DKK3甲基化0例，甲基化率為0%，提示結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制與DKK3甲基化異常緊密相關(guān)。

本研究中，結(jié)腸癌患者結(jié)腸鏡活檢組織DKK3甲基化在分化程度、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Dukes分期和手術(shù)切除方面均有差異。姑息性手術(shù)、C+D期、腫瘤最大徑≥5cm、低+中分化、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者DKK3甲基化率高于根治性手術(shù)、A+B期、腫瘤最大徑<5cm、高分化、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。在R0切除率、總生存時(shí)間、5年生存率方面，COC組DKK3甲基化患者低于未甲基化患者，提示DKK3甲基化在結(jié)腸癌病情及預(yù)后評(píng)估中應(yīng)用價(jià)值較高。目前，對(duì)于結(jié)腸癌及其預(yù)后評(píng)估多依據(jù)術(shù)后病理，但其僅可在術(shù)后才可獲得客觀證據(jù)，其對(duì)于無(wú)法獲得術(shù)后病理評(píng)價(jià)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者則無(wú)任何價(jià)值，且手術(shù)后病理無(wú)法在術(shù)前為病情及預(yù)后提供證據(jù)[11-12]。實(shí)踐證明，結(jié)腸鏡活檢較術(shù)后病理檢查更加方便快捷，不但能于術(shù)前獲取客觀證據(jù)，對(duì)于無(wú)法手術(shù)患者也具有較高的臨床價(jià)值。和常規(guī)標(biāo)志物相比較，DKK3甲基化建立基因水平之上，其靈敏度及特異性更高，相信隨著快速基因組測(cè)序，基因水平的標(biāo)志物會(huì)更準(zhǔn)確。