單純性肥胖小鼠動物模型的構建及評價*

朱夢夢 張澤家 趙 琳 范瑞瑞 葛少欽,

1 河北大學醫學院，河北省保定市 071002； 2 河北大學中醫學院

隨著人們生活水平、飲食結構的改變，肥胖顯然已經成為全世界共同面臨的公共衛生問題[1]。肥胖癥在臨床上根據病因可分為單純性和繼發性肥胖，單純性肥胖是指沒有明顯神經、內分泌系統形態及功能改變，但伴有脂質、糖代謝調整過程障礙，是臨床中為主導的肥胖類型[2]。為了更好地研究肥胖的病理機制,為治療提供基礎依據，本研究用高脂飲食喂養建立單純性肥胖小鼠模型，通過其Lee’s指數、肝功能酶、血糖血脂的變化以及脂肪體積及分布情況等驗證模型的可重復性，為進一步研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料 3周齡的100只SPF級的雄性C57BL/6N小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006；高脂飼料25kg，購自北京杰美生物科技有限公司；維持飼料10kg，購自北京科澳協力飼料有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 全自動生化儀(7600-110)(日本日立有限公司)，QuantumFX microCT (PerkinElmer)，50%葡萄糖注射液(石家莊四藥有限公司)，胰島素注射液(江蘇萬邦生化醫藥集團有限責任公司)，血糖試紙、血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組:將100只雄性小鼠隨機分為正常組(20只)和模型組(80只)。共造模10周，每周稱量兩組小鼠的體重，造模10周后測量小鼠體長、腰圍，根據公式計算Lee’s指數[Lee’s指數=體重1/3(g)/體長(cm)×103]。

1.3.2 葡萄糖耐量實驗(Glucose tolerance test, GTT)和胰島素抵抗實驗(Intraperitoneal insulin tolerance test,ITT)：GTT：將小鼠禁食不禁水12h之后，按每只小鼠體重給藥(4μl/g)腹腔注射濃度為50%的葡萄糖溶液;ITT：將小鼠禁食不禁水6h之后，按每只小鼠體重給藥(0.75IU/g)腹腔注射胰島素溶液，都分別于第 0、15、30、60、90、120min 時剪小鼠尾尖的一部分獲得靜脈血，隨即用血糖試紙測量血糖值，并記錄數據。

1.3.3 小動物CT成像(micro-CT)：麻醉小鼠并將其固定于鼠床上進行掃描，將掃描所得的投影數據進行重建并導入分析軟件進行分析，選取參照點，調整密度區間，檢測小鼠皮下、腹部和內臟脂肪的分布，然后根據各個層面進行疊加計算得出總的脂肪體積。

1.3.4 血清生化指標的測定：采用全自動生化儀檢測血清中ALT、AST、GGT、GLU、TC 、TG、HDL、LDL和VLDL的水平。

1.4 統計學方法 所有數據均用SPSS19.0軟件進行統計，定量資料以均數±標準差表示，數據采用直觀分析法和獨立樣本t檢驗相結合進行統計。以α=0.05作為檢驗統計量。P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模期間小鼠的體重變化 表1中顯示，喂養高脂飼料前，兩組小鼠間體重無差異(P>0.05)，造模10周后，模型組小鼠體重比正常組高出37.2%(P<0.01)，說明單純性肥胖模型造模成功。80只模型組小鼠中，共有71只小鼠建立為單純性肥胖模型，造模成功率為88.75%。

表1 造模期間小鼠體重變化

2.2 小鼠體長、腰圍及Lee’s指數的比較 表2結果顯示，模型組小鼠的體長、腰圍、Lee’s指數均大于正常組(P<0.01)。

表2 兩組小鼠體長、腰圍及Lee’s指數的比較

2.3 兩組小鼠的脂肪體積以及分布情況 表3所示，模型組小鼠的脂肪總體積高于正常小鼠(P<0.01)，從圖1中可以看出模型組小鼠的皮下、腹部脂肪和內臟脂肪分布明顯多于正常組小鼠。

表3 兩組小鼠脂肪總體積的比較

圖1兩組小鼠的脂肪分布圖

A為正常組，B為模型組 A4、B4是合成的立體圖 A1、B1為小鼠上切面圖 A2、B2為小鼠正切面圖 A3、B3為小鼠側切面圖

2.4 兩組小鼠肝功能酶水平的比較 表4所示，肥胖小鼠的AST、ALT水平均高于正常飲食小鼠(P<0.01)，而GGT水平無差異(P>0.05)。

2.5 兩組小鼠的血糖、血脂水平 表5所示，模型組小鼠血糖水平高于正常組小鼠(P<0.01)。模型組小鼠血清TC、HDL、LDL、VLDL含量高于正常組(P<0.01)，TG含量低于正常組小鼠(P<0.01)。

表4 兩組小鼠肝功能酶水平的比較

2.6 兩組小鼠的GTT、ITT比較 圖2顯示，GTT實驗中兩組小鼠血糖在15min時升到最高，之后正常組開始均勻下降， 模型組在30min時仍然很高，而且模型組小鼠在每個檢測的時間節點血糖值都高于正常組(P<0.01)。ITT實驗結果表明，正常組小鼠血糖在60min時降到最低，而模型組小鼠血糖濃度在30min時降到最低，并且模型組小鼠在每個檢測的時間節點血糖值都高于正常組(P<0.01)，表明模型組小鼠出了葡萄糖耐量異常和胰島素抵抗的現象。

表5 兩組小鼠血糖血脂水平的比較

ITT血糖變化圖

3 討論

研究證實，肥胖不僅是引發糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化等代謝性疾病的獨立危險因素，也與癌癥等疾病密切相關，已成為人類健康的絆腳石[3]。而單純性肥胖是指無其他疾病誘發，純粹是能量攝入超過消耗引起的肥胖[4]。想要更好地研究單純性肥胖的作用機制及治療方法，首先建立適宜的動物模型是研究的重要基礎，是揭示單純性肥胖的發生機制以及藥物治療機理的必要條件。

制備動物肥胖模型的方法較多, 如谷氨酸單鈉選擇性損傷下丘腦[5]、電刺激損傷[6]等均可制作成實驗性肥胖動物模型，但這些方法操作復雜且均是下丘腦性肥胖模型，為模仿單純性肥胖，本實驗采用高脂飲食誘導方式建立單純性肥胖小鼠動物模型，方法簡便易行。高脂喂養1周后，模型組小鼠的體重明顯增長，并持續至實驗末，與對照組比平均增長 37.2%。若以體重增加20.0%作為肥胖標準，單純性肥胖小鼠造模成功率為88.75%。有研究表明肥胖會導致體內血糖、血脂、肝功能指標以及內分泌激素水平發生一定的變化[7]，因此小鼠肥胖的衡量標準除體重、Lee’s指數外，血清中AST、ALT、GGT、GLU、TC、TG、HDL、LDL和VLDL的水平均是評價單純性肥胖動物模型是否成功的重要指標。實驗結果顯示，模型組小鼠血清GLU、TC、HDL、LDL、VLDL水平高于正常組并與體重呈明顯正相關，血清中AST、ALT水平高于正常組小鼠，出現輕度肝損傷現象，而GGT水平無明顯變化，說明沒有嚴重的肝損傷情況，通常ALT和AST升高程度與肝細胞受損程度相一致。此外，采用micro-CT對小鼠進行掃描，能更直觀地分析肥胖小鼠的脂肪分布情況，從圖1中可以看出模型組小鼠腹部、皮下脂肪增加較多，脂肪總體積明顯高于正常組小鼠。從圖2中的GTT與ITT血糖變化圖顯示出模型組小鼠出現了葡萄糖耐量異常及胰島素抵抗現象，但空腹血糖水平仍在正常范圍之內(7.0～11.5mmol/L)。以上均說明了單純性肥胖小鼠模型構建成功。

綜上所述，本研究建立的單純性肥胖小鼠模型操作簡單，造模條件量化、可控、造模周期相對較短、模型基本穩定。可作為開展單純性肥胖基礎研究的動物模型，為開發治療單純性肥胖的有效藥物提供基礎實驗依據。