前列腺癌中HMBOX1的表達水平及其對細胞上皮間質化的影響*

陳立，謝波，葉文鑫，張心男

（浙江省立同德醫院 泌尿外科，浙江 杭州 310012）

前列腺癌（prostate cancer, PC）在男性惡性腫瘤發病率中居第2 位，并呈逐年遞增的趨勢[1]。PC 發病隱匿，確診時往往發展至晚期，存在腫瘤浸潤或遠處轉移等，失去根治性手術治療的機會，因此PC 早期診斷及治療水平的提高迫在眉睫[2]。Homeobox 基因家族在胚胎與器官發育、腫瘤的形成發展中發揮著重要的調控功能[3]。HMBOX1（Homeobox containing 1）是2006年在人胰腺cDNA 文庫中新發現的基因，屬于Homeobox 家族中的肝細胞核因子基因簇（HNF class），廣泛表達于人體各器官組織中。作為一種新型的轉錄抑制因子調控胚胎發育和細胞分化以及腫瘤的發生、發展[4]。本研究旨在探究HMBOX1 在PC 中的表達變化及其對前列腺癌上皮間質化的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月—2017年10月在浙江省立同德醫院泌尿外科確診為PC 并接受根治性前列腺切除術的68 例作為研究對象（PC 組）。其中，年齡32 ～74 歲，平均（60.50±8.03）歲；腫瘤直徑＜2.5 cm 31 例，≥2.5cm 37 例；Gleason 評分2 ～4 分24 例，5 ～7分30 例，8 ～10 分14 例；TNM 臨 床 分 期Ⅰ、Ⅱ期30 例，Ⅲ、Ⅳ期38 例；前列腺特異抗原（prostate specific antigen, PSA）水平＜10ng/ml 33 例，≥10ng/ml 35 例；有淋巴結轉移36 例，無淋巴結轉移32 例。選取同期本院就診的良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia， BPH）患者70 例作為對照組（BPH 組）。納入標準：①經病理學檢測首次確診為PC 患者并行根治性前列腺切除術；②所有患者術前未接受手術、放化療等抗癌治療；③臨床及隨訪資料完整；④無糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、嚴重自身免疫性疾病或其他惡性腫瘤；兩組患者的年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。研究經本院醫學倫理委員會批準，且所有患者自愿簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

細胞系PC-3 購自上海科興生化試劑，pMD2.0 G 和pAXAS2 質粒購自山東維真生物科技有限公司，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和HMBOX1 兔多克隆抗體均購自英國Abcam 公司，DAB顯色液和蘇木精染色液購自北京中杉金橋生物科技有限公司，HRP 標記二抗、PEG8000、嘌呤霉素均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Transwell 小室、Matrigel 基質膠購自美國Corning 公司，普通光學顯微鏡、熒光顯微鏡均購自日本Olympus 公司。

1.3 免疫組織化學法檢測HMBOX1 的表達

組織標本常規脫水、透明、包埋、切片處理后，依次于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中處理4min。自來水沖洗，檸檬酸鹽緩沖液中煮沸10min，蒸餾水沖洗2 次，5min/次。3%過氧化氫溶液孵育10min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 次，每次5min。1%牛血清清蛋白室溫封閉1h。1 ∶300 稀釋Anti-HMBOX1 兔多克隆抗體，4℃孵育過夜。PBS 洗滌2 次，每次5min。辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1h，PBS 洗滌2 次，每次5min。雙花扁豆凝集素顯色液顯色10min，流動自來水沖洗5min。蘇木精復染1min，自來水沖洗5min。1%鹽酸乙醇分化3s，自來水沖洗5min。依次在70%、80%、90%、95%、100%梯度乙醇、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中處理4min，中性樹膠封片。判定標準：每張切片隨機選擇3 個高倍視野，綜合陽性細胞比例和染色強度進行評分。陽性細胞比例：0 分為陽性細胞比例＜5%，1 分為陽性細胞比例5%～＜25%，2 分為陽性細胞比例25%～＜50%，3 分為陽性細胞比例50%～＜75%，4 分為陽性細胞比例≥75%。染色強度：0 分為不著色，1 分為淡黃色，2 分為黃色，3 分為棕黃色或褐色。陽性細胞比例與染色強度總分0 ～3 分為HMBOX1 低表達，4 ～7 為HMBOX1 高表達。

1.4 HMBOX1 過表達細胞系構建

分子克隆構建plenti-GFP-HMBOX1 慢病毒表達載體，將輔助質粒pMD2.0 G 和pAXAS2 分別與plenti-GFP-HMBOX1 或plenti-GFP 空載共同轉染HEK293T細胞，轉染12 h 后更換新鮮DMEM 培養基，在48 和72 h 時分別收集細胞培養上清液，收集的病毒溶液按每4 ∶1 的比例加入PEG8000 進行濃縮，4℃靜置12 h，8 000 r/min 離心20 min，沉淀用新鮮DMEM重懸后加入到處于對數生長期的PC-3 細胞中，感染48 h 后，嘌呤霉素（1 μg/ml）篩選1 ～3 d，顯微鏡下觀察，當存活細胞全部表達綠色熒光時即穩定細胞系構建成功。plenti-GFP 空載和plenti-GFP-HMBOX1細胞系分別為對照組和實驗組。

1.5 Western blotting 檢測HMBOX1、E-cadherin及Vimentin 的表達

PC-3 HMBOX1及對照組穩定細胞系構建成功后，分別計數2×106個細胞，12 000 r/min 離心3 min，收集細胞沉淀，加入200 μl SDS 上樣緩沖液，沸水浴煮10 min，SDS-PAGE 電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。1 ∶1 500 稀釋的HMBOX1 和Vimentin、1 ∶500稀釋的E-cadherin 兔多克隆抗體4℃孵育過夜。PBS洗滌3 次，8 min/次。1 ∶5 000 稀釋的羊抗兔HRP二抗室溫封閉1 h，ECL 化學發光液顯影。以GAPDH作為內參。

1.6 劃痕實驗（Wound-Healing Assay）

將處于對數生長期的PC-3 HMBOX1 過表達及對照組細胞用胰酶消化后，DMEM 完全培養基重懸。以60%的細胞密度鋪96 孔板，每組設置3 個平行復孔。37℃，5%二氧化碳CO2培養箱過夜。更換低濃度血清培養基（1% FBS），用1ml 槍頭對準96 孔板下端中央部位，向上輕推形成劃痕，PBS 漂洗3 次，低濃度血清培養基繼續培養。在12h 時使用細胞成像設備掃版進行掃描讀板，采用Image J 分析劃痕的修復狀況。

1.7 Transwell 檢測HMBOX1 過表達對細胞侵襲能力的影響

分別收集PC-3 HMBOX1 過表達及對照組細胞，PBS 洗滌3 次，重懸于無血清DMEM 培養基中，并調整細胞濃度至5×105個/ml。取100 μl 細胞懸液接種于Transwell 小室，下室則加入含10%血清的DMEM完全培養基500μl。培養24h 后，Transwell 小室用PBS 洗2 次，甲醇溶液固定30 min。PBS 洗2 次，0.1%結晶紫染色20min。PBS 洗2 次，然后用棉簽輕輕拭去上層未侵襲的細胞，光學顯微鏡下隨機選擇5 個視野并統計平均穿膜細胞數。

1.8 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以平均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HMBOX1 在PC 組織中的表達變化

免疫組織化學檢測及統計結果顯示，HMBOX1 蛋白主要定位于細胞核和胞質中。BPH 組HMBOX1 蛋白的陽性表達率為55.71%（39/70），PC 組HMBOX1蛋白的陽性表達率下降至19.12%（13/68），兩組比較，差異有統計學意義（χ2=15.023，P=0.000）。見圖1。

2.2 HMBOX1 過表達對Vimentin 和E-cadherin的影響

Western blotting 結果顯示，細胞中HMBOX1、E-cadherin、Vimentin 蛋白的相對表達水平，對照組分別為（0.33±0.04）、（0.41±0.06）、（2.15±0.17），實驗組分別為（1.91±0.14）、（1.70±0.15）、（0.62±0.05）。HMBOX1 在對照組細胞中的表達水平較低，而在實驗組細胞中的表達水平增加（t=13.026，P=0.000），表明HMBOX1 過表達穩定細胞系構建成功。與對照組細胞比較，實驗組E-cadherin 的表達水平增加，Vimentin 的表達水平下降，差異有統計學意義（t=5.377和8.706，P=0.021 和0.006）。見圖2。

2.3 HMBOX1 過表達對PC-3 細胞遷移的影響

與對照組細胞愈合度（87.42±9.10）比較，實驗組細胞12h 后的劃痕愈合度（41.33±9.10）增加，差異有統計學意義（t=4.187，P=0.007）。見圖3。

2.4 HMBOX1 過表達對PC-3 侵襲的影響

對照組和實驗組侵襲至Transwell 上室膜上的細胞數分別為（421.88±45.70）和（172.06±19.25）個，實驗組侵襲細胞數低于對照組，差異有統計學意義（t=9.507，P=0.004）。見圖4。

圖1 HMBOX1 在不同組織中的表達 （×200）

圖2 HMBOX1 過表達對Vimentin 和E-cadherin 的影響

圖3 HMBOX1 過表達對PC-3 細胞遷移的影響 （×200）

圖4 HMBOX1 過表達對PC-3 侵襲能力的影響 （×400）

3 討論

HMBOX1并在人類胰腺、肝臟、腦及胎盤等組織中呈高表達[5]。已有文獻報道，Homeobox 家族基因在細胞增殖和凋亡、血管生成、DNA 修復以及腫瘤轉移等生物學過程中起重要作用[6-7]。目前關于HMBOX1基因的研究仍處于初始階段，主要集中在對NK 細胞的殺傷調控、參與骨髓基質細胞向血管內皮細胞分化及DNA 的修復等[8]。此外HMBOX1 在腫瘤中的表達異常也引起眾多學者的關注，如HMBOX1 在肝癌、神經膠質瘤以及卵巢癌中低表達，而在腎透明細胞癌中呈高表達，廣泛參與腫瘤形成及進程調控[9-10]。本研究發現HMBOX1 蛋白在前列腺癌組織中的表達水平較前列腺增生組織下降，表明HMBOX1 蛋白可能在前列腺癌的發生及進展中扮演著重要的角色。

Ⅲ型細胞上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是指原本具有上皮細胞特性的腫瘤細胞失去細胞極性，獲得間質細胞的特性，細胞形態趨長梭形，具備更強的移動能力，更易從原始部位脫離，通過血液或淋巴系統定植遠處器官或組織，進而導致腫瘤的遠處轉移[11]。大量研究顯示，EMT 與腫瘤的發生、轉移、免疫抑制以及耐藥等密切相關[12]。EMT 的發生涉及大量轉錄因子的表達變化及Wnt/β-catenin、Notch、STAT3、PI3K/Akt、Pten 等多種信號通路，并伴隨上皮細胞標志蛋白E-cadherin、角蛋白的下調及間質細胞標志蛋白神經鈣黏蛋白（N-cadherin）、Vimentin 的上調[13-14]。已有研究表明PC 組織中EMT相關蛋白的表達水平發生變化，并與PC 的分期、組織分級、轉移以及復發等存在緊密的聯系[15]。

本結果顯示，與對照組PC 細胞比較，過表達HMBOX1 的細胞中E-cadherin 的表達水平增加，Vimentin 的表達水平則下降，劃痕創口愈合慢，遷移速度降低。Transwell 小室實驗也同時證明過表達HMBOX1 的細胞較對照組細胞比較，其黏附性增強，細胞穿膜數降低。這表明過表達HMBOX1 后，PC 細胞的EMT 現象得到抑制，腫瘤細胞的侵襲遷移能力受到明顯的削弱。既往研究表明，HMBOX1 可能通過多種途徑參與腫瘤信號通路的調節，如HMBOX1 通過NKG2D/DAP10 信號途徑來抑制NK 細胞對腫瘤細胞的殺傷功能[16]。本研究證明，HMBOX1 與前列腺癌EMT 相關信號通路的調節有密切關系。EMT 受Snail、Zeb、Twist等眾多重要轉錄因子及Wnt、Notch、STAT3、PI3K/Akt等信號通路的復雜調控[17]，本研究雖然證明，轉錄抑制因子HMBOX1 可能通過EMT 相關路徑參與PC 的作用機制，但其也可能通過其他作用靶標發揮PC 抑制效應，并且HMBOX1 究竟通過何種信號通路調控PC EMT 現象也有待進一步研究。

綜上所述，HMBOX1 在PC 組織中表達下調，HMBOX1 過表達能抑制PC 的上皮間質化現象及腫瘤的侵襲轉移，有望成為PC 診斷及治療的新靶點。