蘇蘇小兒止咳顆粒提取工藝研究中鞘蕊蘇的質量控制

張 慧，何建華，顧成剛，朱麗玲，吳 寧△

（1．武漢軍谷坊科技開發有限公司，湖北 武漢 430075； 2．武漢藥谷科技開發有限公司，湖北 武漢 430075）

小兒咳嗽為兒科臨床常見病，易反復發作，目前用于小兒咳嗽的中成藥中，以治療熱咳的藥物居多，專用于小兒寒咳的極少，且療效較快的藥物大多含有麻黃堿、可待因等藥物，不適于小兒服用。針對這一現狀，本課題組研制了蘇蘇小兒止咳顆粒。其屬中藥新藥注冊6．1類，已獲國家藥物臨床試驗批件和發明專利證書，處方來源于醫院臨床應用多年的經驗方，對治療外感風寒所致的小兒咳嗽臨床療效確切。處方由化橘紅、鞘蕊蘇、紫蘇葉等5味中藥組方，具有宣肺解表散寒、理氣化痰止咳之功效，用于小兒風寒咳嗽癥，癥見咳嗽頻作、咳痰稀白、鼻流清涕、惡寒無汗、頭身疼痛、舌淡苔白、脈浮緊、指紋色淡。鞘蕊蘇為方中為臣藥，是唇形科植物毛喉鞘蕊花Coleus forskohlii（Willd．）Briq．的干燥全草，具有下氣平喘、平肝之功，用于喘咳、眩暈、目脹昏花，如支氣管哮喘、咳嗽、青光眼、高血壓［1］。滇產毛喉鞘蕊花中主要成分為異佛司可林（isoforskilin）［2］，是目前所知的腺苷酸環化酶激活劑，即不通過受體，亦不通過抑制磷酸-Ⅱ酶，可直接提高血漿中環磷酸腺苷（cAMP）水平，直接舒張支氣管平滑肌，從而起到明顯的止喘抗炎作用［3-4］。異佛司可林在鞘蕊蘇藥材中含量較低，且無紫外吸收，在復方中鮮有將其作為檢測指標的報道，但其作為處方中的藥效成分，有必要對其含量測定方法進行考察，為提取工藝研究優選最佳工藝參數提供依據。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；2000-ES型蒸發光散射檢測器（美國奧泰公司）；204AL型電子天平（德國梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1．2 試藥

異佛司可林對照品（美國Sigma公司，批號為A04016-13072506，含量按97．8%計）；水為娃哈哈純凈水；色譜甲醇、乙腈均由湖北昌泰興業科技有限公司提供；柱層析用硅膠（100～200目，化學純，青島海浪硅膠干燥劑有限公司）；甲醇，乙酸乙酯、二氯甲烷均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司提供；蘇蘇小兒止咳顆粒70%醇提液、鞘蕊蘇陰性樣品均為武漢藥谷科技開發有限公司自制。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（150 mm×4．6 mm，5μm）；柱溫：40℃；流動相：乙腈-2．5%冰醋酸溶液（40∶60，V／V）；流速：1．0 mL／min；進樣量：5μL，10μL（外標兩點法）；2000-ES型蒸發光散射檢測器，汽化溫度：103℃，氮氣流速：2．8 L／min。

2．2 溶液制備

對照品溶液：取異佛司可林對照品11．98 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得0．468 6 mg／mL的對照品貯備液；精密吸取5 mL貯備液置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻，得0．093 7 mg／mL的對照品溶液。

供試品溶液：取蘇蘇小兒止咳顆粒70%醇提液（按處方比例分別稱取化橘紅、鞘蕊蘇、紫蘇葉、桔梗各50 g，甘草25 g，加10倍量70%乙醇，提取2次，每次1 h，濾過，合并濾液，即得）150 mL，精密稱定，置水浴上蒸干，殘渣加水30 mL加熱使溶解，用二氯甲烷振搖提取4次，第1次30 mL，其余3次每次20 mL，合并二氯甲烷液，加水50 mL洗滌，棄去水液，回收溶劑至約5 mL，加入硅膠（100～200目）1．0 g，拌勻，揮干，移至硅膠柱（內徑1．5 cm，硅膠8 g，濕法裝柱）上，先用二氯甲烷-乙酸乙酯（9∶1，V／V）80 mL洗脫，棄去洗脫液，再用二氯甲烷-乙酸乙酯（75∶25，V／V）100 mL洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，用甲醇溶解并轉移至5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

陰性對照品溶液：按處方比例稱取除鞘蕊蘇外的其他藥材，按蘇蘇小兒止咳顆粒70%醇提液的制備工藝制成陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2．3 方法學考察

專屬性試驗：精密量取對照品溶液、陰性供試品溶液、供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果見圖1。可見，陰性對照品溶液色譜在與異佛司可林相應位置上無吸收峰出現，異佛司可林與其他成分色譜峰達到基線分離。

圖1 高效液相色譜-蒸發光散射色譜圖

線性關系考察：取對照品溶液，分別進樣1，3，5，7，10，15，20μL，按擬訂色譜條件測定，以進樣量的常用對數值為橫坐標（X）、峰面積的常用對數值為縱坐標（Y）繪制標準曲線，線性回歸方程為Y＝1．715X＋5．504 6，r＝0．999 8（n＝7）。結果表明，異佛司可林進樣量在0．093 7～1．874 0μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取同一對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣5μL，連續進樣6次，記錄色譜圖，計算色譜峰峰面積對數。結果RSD為0．14%（n＝6），表明儀器精密度較好。

穩定性試驗：取同一份供試品溶液，分別在制備后0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h時按擬訂色譜條件進樣測定。結果異佛司可林色譜峰峰面積對數的RSD為0．28%（n＝13），表明供試品溶液在常溫下放置24 h穩定性良好。

重復性試驗：平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果異佛司可林的平均含量為2．002 4μg／g，RSD為1．37%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品溶液（含量為2．002 4μg／g）6份，每份約75 mL，精密稱定，置蒸發皿中，精密加入83．325μg／mL的對照品溶液2 mL，置水浴上蒸干，制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果見表1。

表1 異佛司可林加樣回收試驗結果（n＝6）

2．4 工藝研究樣品測定

鞘蕊蘇在本處方中為臣藥，擬以其所含主要成分異佛司可林為指標成分，對不同濃度乙醇提取液進行檢測，得出指標成分轉移率高的較優乙醇濃度范圍，再在此范圍內進行正交試驗，以提取次數（因素A）、提取時間（因素B）、加醇量（因素C）、乙醇濃度（因素D）確定優化后的提取條件，并進行正交驗證試驗，確定最優提取條件。異佛司可林提取轉移率＝（各提取液中異佛司可林的含量×對應提取液的質量）／（鞘蕊蘇異佛司可林含量×鞘蕊蘇的投料量）×100%。結果見表2至表6。結合君藥化橘紅中柚皮苷的轉移率，確定蘇蘇小兒止咳顆粒提取正交試驗乙醇濃度為60%～80%?？梢?，提取次數和加醇量對異佛司可林轉移率有顯著影響，最優提取條件為A3B2C3D2；提取3次與2次相比，加醇量10倍與12倍，異佛司可林的提取轉移率相差均不大，從工業生產結合能源耗損來分析，臣藥鞘蕊蘇中異佛司可林最佳提取條件為A2B2C2D2。各驗證試驗提取液的異佛司可林提取轉移率均大于75%，RSD小于2．0%，表明提取2次，加醇量為10倍能將有效成分提取完全。故確定最佳提取工藝條件為：加10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1．5 h。

表2 工藝提取預試驗異佛司可林的測定結果

表3 醇提因素水平表

表4 醇提正交試驗結果

表5 異佛司可林轉移率方差分析表

表6 醇提正交驗證工藝異佛司可林轉移率試驗結果

3 討論

處方中鞘蕊蘇有效成分異佛司可林只有紫外末端吸收，目前對鞘蕊蘇異佛司可林含量測定報道主要有2種方法：一是選用紫外檢測器測定，采用末端吸收波長210 nm［5-6］；二是采用高效液相色譜-蒸發光散射（HPLC-ELSD）法，使用流動相乙腈-水系統［7］。采用紫外檢測波長210 nm測定時，由于異佛司可林含量低、雜質峰相對較大，無論是調節流動相比例還是調節流動相酸度、柱溫，都無法將主峰與雜質峰分開。采用HPLCELSD，使用流動相乙腈-水系統時異佛司可林主峰與雜質峰完全重合，陰性樣品有干擾。該2種方法對蘇蘇小兒止咳顆粒樣品的分離度有限，陰性樣品總會有干擾。本研究中以HPLC-ELSD法測定異佛司可林含量時，在流動相中加入揮發性的酸，使本來與主峰重疊的雜質峰，得到了完全分離，分離效果得到極大改善，方法可行。

關于鞘蕊蘇中異佛司可林含量測定，按2015年版《中國藥典（四部）》通則0512中高效液相色譜法測定。分別精密吸取對照品溶液5，10μL，供試品溶液5～10μL，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法常用對數方程計算即得。本品按干燥品計算，含異佛司可林（C22H34O7）不得少于0．01%。工藝研究中各試驗樣品投料用鞘蕊蘇異佛司可林含量按本法測定為151．7μg／g。

蘇蘇小兒止咳顆粒樣品中異佛司可林含量相對較低，要達到檢測要求，取樣量較大，直接濃縮加硅膠拌勻時發現樣品黏性較強，呈團塊狀不易分散，加至硅膠柱上時干擾洗脫，故根據異佛司可林的溶解性，以有機溶劑萃取純化，但萃取后的樣品中仍含有較多雜質，顏色較深，對異佛司可林的測定產生干擾，且易降低色譜柱的柱效和使用壽命，因而仍有必要進一步通過硅膠柱對萃取后的樣品進行純化。以二氯甲烷-乙酸乙酯不同比例混合，進行梯度洗脫，通過系列對比試驗確定了硅膠柱的內徑、用量，以及二氯甲烷-乙酸乙酯洗脫劑的最佳用量。以上研究方法為中藥新藥研發過程中相對含量較低的復雜成分的質量控制提供了一定的研究思路。