紫草總色素β-環糊精包合物的定性鑒別及左旋紫草素含量測定*

李俊江，劉向娥，李季文，張增志，牛建雄

（1．甘肅省中醫院科研制劑中心，甘肅 蘭州 730050； 2．甘肅省中醫院白銀分院，甘肅 白銀 730900；3．甘肅隴中藥業有限公司，甘肅 白銀 730900）

紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst．或內蒙紫草Arnebia guttataBunge的干燥根［1］，主要活性成分為多種羥基萘醌類化合物（紫草羥基萘醌總色素）［2-3］，藥用活性廣泛，但普通口服制劑的穩定性較差。β-環糊精包結紫草總色素可避免紫草總色素及衍生物長時間在光、空氣和高溫環境下產生聚合作用而失去活性［4-6］，擴大臨床使用范圍。本研究中對紫草總色素β-環糊精包合物進行了定性鑒別與含量測定，建立了薄層色譜（TLC）鑒別及高效液相色譜（HPLC）含量測定方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

PerkinElmer A-10型高效液相色譜儀（美國PerkinElmer公司），包括717自動進樣器，二極管陣列檢測器（DAD）；HS6150型超聲波清洗儀（天津恒奧科技發展有限公司）；Mettler AE240型電子分析天平（德國Sartorius賽多利斯公司，萬分之一）；HXGZ-000800型電熱恒溫干燥箱（連云港醫療器械設備廠）；薄層板（自制）。

1．2 試藥

紫草藥材由甘肅省中醫院藥劑科提供，經甘肅省中醫院藥學部汪付田主任中藥師鑒定為正品；紫草總色素β-環糊精包合物（甘肅省中醫院科研制劑中心制備，批號分別為20160906，20160915，20160918，20160920，20160925，20161211）；左旋紫草素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110769-200405，供含量測定用）；β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111689-200502）；β-環糊精（江蘇豐園生物技術有限公司，相對分子質量為1 134．98，含量≥98%）；乙腈、甲醇（天津光復精細化工研究所，色譜純）；其他試劑均為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結果［7］

2．1 薄層色譜鑒別

取總萘醌包合物0．5 g，加石油醚20 mL，超聲20 min，濾過，濾液濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。同法制得β-環糊精陰性對照品溶液。另取β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品、左旋紫草素對照品適量，配成對照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502薄層色譜法試驗，分別吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照品溶液各10μL，點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0．5∶0．1，V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%氫氧化鉀甲醇溶液，顯色。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾（詳見圖1）。

圖1 薄層色譜圖

2．2 含量測定

2．2．1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0．025 mol／L磷酸（82∶18，V／V）；流速：0．8 mL／min；檢測波長：516 nm；柱溫：室溫；進樣量：10μL［8］。理論板數不低于4 000，且分離度大于1．5。

2．2．2 溶液制備

取左旋紫草素對照品5．11 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇配制成質量濃度為1．022 mg／mL的溶液，即得對照品溶液。取包合物0．25 g，置30 mL三角瓶中，加甲醇20 mL，超聲（300 W，25 kHz）10 min，0．45μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得供試品溶液。按包合物的處方比例稱取環糊精制得陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2．2．3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果供試品溶液與對照品溶液在相同時間出峰，左旋紫草素達到較好分離，峰形良好，陰性對照無干擾。色譜圖見圖2。

線性關系考察：吸取對照品溶液適量，分別用甲醇稀釋至每1 mL含左旋紫草素20．4，40．8，81．6，163．2，326．4μg的溶液，按擬訂色譜條件進樣10μL，每個質量濃度進樣3次，以質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y＝9×105X-50 121，r＝0．999 6。結果表明，左旋紫草素質量濃度在20．4～326．4μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取質量濃度為81．6μg／mL的對照品溶液10μL，按擬訂色譜條件分別于不同時間連續進樣6次。結果左旋紫草素峰面積的RSD為0．85%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別在0，4，8，12，18，24 h時按擬訂色譜條件各進樣10μL測定。結果左旋紫草素含量的RSD為1．26%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為20160925）6份，同法制備供試品溶液，精密吸取10μL進樣，記錄峰面積。結果樣品中左旋紫草素的平均含量為5．58 mg／g，RSD為1．46%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的包合物（批號為20160906）0．25 g（左旋紫草素含量為5．3 mg／g），精密稱定，共6份，分別加入1．022 mg／mL左旋紫草素對照品溶液1 mL，按2．2．2項下樣品處理方法處理，按擬訂色譜條件進樣測定含量，計算回收率。結果見表1。

2．4 樣品含量測定

取已制備的3批樣品（批號分別為20160906，20160920，20160925），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件平行進樣3次，記錄峰面積，以外標法計算含量。結果3個批次樣品中左旋紫草素含量分別為5．3，5．4，5．6 mg／g。

圖2 高效液相色譜圖

表1 左旋紫草素加樣回收試驗結果（n＝6）

3 討論

紫草臨床應用廣泛，主要用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、瘡瘍、濕疹、水火燙傷、凍傷、流行性腮腺炎、色素性紫癜和過敏性紫癜等，尤其對糖尿病造成的大面積潰瘍傷口的愈合效果很好［3-4，9-10］。另外，以紫草為主藥治療皮膚白斑、銀屑病、乳腺增生、神經衰弱、精神分裂癥等均可獲得較好的臨床療效［2］。近年來，又陸續發現紫草具有保肝、抗腫瘤、免疫調節作用，臨床可用于急慢性肝炎、絨毛膜上皮癌等的治療。紫草藥理作用及臨床應用很多，如抗菌抗炎、抗病毒、抗癌、抗生育、抗氧化、抗衰老、降糖、保肝及提高機體免疫功能［2-4，11-15］。

羥基萘醌化合物為紫草色素的主要組成部分，化學結構由母體萘茜（5，8-dihydroxy-y-1，4-naphthoquinone）與側鏈部分相連而成，化學性質與母體有許多相似之處［6］。羥基的引入使得其比母體更不穩定，但具有更豐富的特性。羥基萘醌具有重要生物活性和應用前景，但易受自然界光照、溫度、pH、氧化劑、金屬離子等的影響而發生降解、氧化、聚合、螯合等變化，改變其穩定性［5-6］。紫草的諸多藥理活性使其具有廣闊的臨床應用前景，但因紫草總色素及衍生物長時間在光、空氣和高溫環境下產生聚合作用，聚合后則失去活性，口服制劑的穩定性較差，導致紫草的臨床應用經常以紫草油等外用劑型多見，單味及復方的口服制劑較少見，臨床使用受到了較大限制。

β-環糊精包合物是一種超微型的藥物載體，原料是環糊精（CYD）。β-CYD是以7個葡萄糖分子以1，4-糖苷鍵連接，筒狀結構，筒內壁空腔為0．6～1．0 nm，由于葡萄糖的羥基分布在筒的兩端并在外部，糖苷鍵氧原子位于筒的中部并在筒內，β-CYD的兩端和外部為親水性，而筒的內部為疏水性，借范德華力將一些大小和形狀合適的藥物分子包合于環狀結構中，形成超微囊狀包合物，供口服或注射，在體內經酶水解釋放出藥物［16］。采用β-環糊精包合技術克服因有效成分性質不穩定給提取和制備帶來的困難，為含紫草的復方及單味藥內服制劑的研制提供了創新思路和技術支持，可穩定含紫草的內服中藥制劑的質量，提高生物利用度，充分發揮其抗菌抗炎、抗病毒、抗癌、降糖、保肝及提高機體免疫的臨床功效。

本研究中對紫草總色素β-環糊精包合物進行定性鑒別和定量測定，采用TLC法、HPLC法對紫草總色素β-環糊精包合物進行質量評價。根據環境和實驗室條件，在HPLC-DAD法測定左旋紫草素含量時，發現若單用甲醇水溶液作為流動相，則左旋紫草素峰形會發生拖尾。加入低濃度酸如0．025 mol／L磷酸，能較明顯地改善峰形［17］。所建立的TLC定性鑒別及HPLC含量測定方法，完善并提高了紫草總色素β-環糊精包合物的質量控制標準。該方法操作簡便、結果準確、專屬性強、重復性好，為紫草總色素β-環糊精包合物質量提供了保障，為含紫草的新制劑研發提供了參考。