金槐痔瘺合劑的質量標準提升及應用*

陳曉雙，馬 靜，費小凡，宋 毅

（四川大學華西醫院臨床藥學部，四川 成都 610041）

金槐痔瘺合劑為院內制劑，屬中藥復方制劑，功能為清熱解毒、涼血止血，主要用于治療痔瘡、出血和疼痛等。金槐痔瘺合劑現行質量標準由四川省食品藥品監督管理局發布，標準文號為SZBZ20080892-10（Z）。槐花、地榆均為處方中的臣藥，槐花具有清熱、涼血、止血等功效，對尿血、痔瘡出血等具有顯著療效［1］，其主要有效成分為黃酮類化合物蘆丁，常用于防治高血壓、出血性疾病等，也可用于治療痔瘡［2-4］；地榆性寒，有涼血止血，清熱解毒，消腫斂瘡之功效［5］。目前，該制劑僅有金銀花、黃柏和芍藥的薄層色譜（TLC）鑒別法，無含量測定項，不能準確定量，質量可控性較差。為了加強該制劑的質量控制，更好地保證臨床療效，故本研究中新增了地榆和槐花的TLC鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對蘆丁進行含量測定及方法學考察［6-7］。現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC-10AT型高效液相色譜儀，CTO-10AS型柱溫箱，SCL-10AT型處理器，SPD-10AVP型檢測器，均購自日本島津公司；ZF-90型多功能暗箱式紫外透射儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；XP205DR型電子分析天平（METTLER TOLEDO公司，十萬分之一）。

1．2 試藥

金槐痔瘺合劑（自制，批號為170327，170531，170703，規格為每瓶500 mL）；地榆對照藥材（批號為121286-200402），槐花對照藥材（批號為121063-201003），沒食子酸對照品（批號為110831-200803，質量分數為90．1%），蘆丁對照品（批號為100080-200707），均購于中國藥品生物制品檢定所。硅膠G薄層板（青島海洋化工廠，規格為100 mm×200 mm）；甲醇為色譜純，石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯、三氯甲烷等其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2．1 TLC鑒別

2．1．1 地榆［8-9］

分別取3批金槐痔瘺合劑10 mL，水浴濃縮至約3 mL，加50%甲醇溶液20 mL，加熱回流提取1 h，放冷，濾過，濾液用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，即得供試品溶液。另取地榆對照藥材0．5 g，同法制備對照藥材溶液。取沒食子酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0．5 mg的對照品溶液。按處方取除地榆之外的其他藥材，照金槐痔瘺合劑制備工藝，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法［10］，吸取供試品溶液和對照藥材溶液10μL，對照品溶液和陰性對照溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-甲酸（7∶5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品、對照藥材溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾（見圖1 A）。

圖1 薄層色譜圖

2．1．2 槐花［11-12］

分別取3批金槐痔瘺合劑3 mL，加石油醚（60～90℃）振搖提取3次，每次10 mL，棄去石油醚液，水液加甲醇30 mL加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，即得供試品溶液。取槐花對照藥材0．5 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴濃縮至約2 mL，即得對照藥材溶液。取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0．2 mg的對照品溶液。按處方取除槐花之外的其他藥材，照金槐痔瘺合劑制備工藝，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法［7］，吸取供試品溶液和對照品溶液各5μL，對照藥材溶液和陰性對照溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-冰乙酸-水（5∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁溶液，在365 nm下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品、對照藥材溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾（見圖1 B）。

2．2 含量測定［13-15］

2．2．1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4．6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0．4%磷酸水溶液（45∶55）；流速：1 mL／min；柱溫：35℃；檢測波長：257 nm；進樣量：10μL。在上述色譜條件下分析，與相鄰組分峰的分離度均大于1．5。

2．2．2 溶液制備

取蘆丁對照品1 mg，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0．1 mg的溶液，0．45μM微孔濾膜過濾，制得質量濃度為0．082 mg／mL的對照品溶液。精密量取金槐痔瘺合劑上清液2 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流2 h，放冷，再稱定質量，75%甲醇補足質量，0．45μM微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。同供試品溶液制備法分別按照制劑處方配比，制備缺槐花的陰性對照溶液。

2．2．3 方法學考察

專屬性考察：精密吸取蘆丁對照品、供試品及陰性對照溶液適量，按擬訂色譜條件分別進樣10μL，記錄色譜圖，見圖2。結果表明，供試品溶液色譜峰與對照品溶液色譜峰的保留時間一致，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。

線性關系考察：分別精密量取質量濃度為0．328 mg／mL的蘆丁對照品貯備液1 mL，甲醇梯度稀釋至終質量濃度分別為0．328 0，0．164 0，0．082 0，0．041 0，0．020 5，0．010 3 mg／mL的蘆丁對照品溶液，定量至1 mL。分別吸取上述溶液各10μL注入液相色譜儀，測定峰面積值。以進樣量（X，mg）為橫坐標、峰面積值（Y）為縱坐標，得蘆丁回歸方程Y＝2×107X＋27 183，r＝0．999 7（n＝6）。結果表明，蘆丁進樣量在0．010 3～0．328 0 mg范圍內與峰面積值線性關系良好。

圖2 高效液相色譜圖

精密度測定：取蘆丁對照品溶液，按擬訂色譜條件重復進樣6次，測定峰面積值。結果蘆丁峰面積的RSD為0．054%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液（批號為170703），室溫下放置，分別于0，1，2，4，8，10 h時按擬訂色譜條件進樣測定峰面積值。結果蘆丁峰面積的RSD為0．013%，表明供試品溶液室溫下放置10 h內穩定。

重復性試驗：精密量取同一樣品（批號為170703），依法平行制備5份供試品溶液，并按擬訂色譜條件進樣測定。結果含量的RSD為0．012%，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的供試品（批號為170703，含蘆丁0．079 0 mg／mL）共6份，分別加入一定質量濃度的蘆丁對照品溶液1 mL（相當于金槐痔瘺合劑中原有質量的100%），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）

2．2．4 樣品含量測定

取3批樣品（批號為170327，170531，170710），依法平行制備3份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，測定峰面積值，計算蘆丁含量。結果蘆丁對照品的蘆丁含量為0．164 mg／mL，各批次樣品的蘆丁含量分別為0．133，0．129，0．132 mg／mL（n＝3）。

3 討論

本研究中分別考察了地榆不同展開劑、點樣量及不同檢視條件，比較了三氯甲烷-甲醇（4∶1）、環己烷-乙酸乙酯-甲酸（7∶5∶1）展開劑的展開結果。結果顯示，采用三氯甲烷-甲醇（4∶1）作為展開劑時，供試品斑點拖尾嚴重。以紫外光254 nm、365 nm和噴以2%三氯化鐵乙醇溶液作為檢視條件，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液時特征斑點最明顯。對槐花薄層鑒別方法方法學考察時，同地榆考察方法，確定以乙酸乙酯-冰乙酸-水（5∶1∶2）作為本品最佳展開系統和噴以2%三氯化鋁溶液，365 nm觀察顯色斑點。

供試品提取工藝中，比較超聲、加熱回流和浸泡過夜3種提取方式。結果顯示，采用加熱回流方式提取時，蘆丁測得含量略高。不同體積分數（50%，75%，100%）甲醇溶液進行提取時，蘆丁的提取含量隨甲醇濃度的增加而升高，當甲醇體積分數達到75%后，提取率略有下降，故選用75%甲醇溶液作為提取溶劑。蘆丁成分提取率隨著時間（30，60，120 min）的增加而升高，綜合考慮提取效率、能源和時間成本等因素，最終選擇提取時間為120 min。

綜上所述，通過對醫院制劑金槐痔瘺合劑的TLC鑒別和含量測定內容進行了補充，并進行了方法學考察，完善并提升了金槐痔瘺合劑的質量標準。