紅景天苷對大鼠骨折術(shù)后認知功能的改善作用及對海馬大麻素2型受體表達的影響

唐保明，李釗偉，楊愛榮，王卓亞

（青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001）

術(shù)后認知功能障礙（POCD）被認為是大手術(shù)的常見并發(fā)癥，特征是術(shù)后短期或／和長期的學(xué)習、記憶和執(zhí)行能力等神經(jīng)心理測試成績較術(shù)前水平有所下降［1］。POCD與住院時間延長、日常功能受損和死亡風險增加等不良結(jié)局有關(guān)［2］。手術(shù)創(chuàng)傷引起的炎性反應(yīng)過程在POCD的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，術(shù)后記憶缺失與血漿和海馬組織中細胞因子水平的升高是平行的，而阻斷炎性反應(yīng)過程可減輕記憶功能障礙［3-4］。在正常的靜息狀態(tài)下，免疫系統(tǒng)能分泌低水平的促炎細胞因子［如白細胞介素1（IL-1）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等］，積極調(diào)節(jié)神經(jīng)回路的重構(gòu)，促進記憶鞏固和神經(jīng)發(fā)生。但這些促炎細胞因子過量生產(chǎn)會引起神經(jīng)毒性反應(yīng)，對記憶和神經(jīng)產(chǎn)生直接的有害影響，最終導(dǎo)致POCD［5］。大麻素2型受體（CB2R）主要存在于外周免疫系統(tǒng)，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥時，腦內(nèi)CB2R表達顯著上調(diào)［6］。CB2R在神經(jīng)系統(tǒng)中的保護作用已在動物模型中得到證實，特別是在阿爾茨海默病和中風的動物模型中［7］。紅景天苷是紅景天的主要有效成分，具有抗氧化損傷、清除自由基和提高記憶力等作用［8］。本研究中通過制備大鼠脛骨骨折模型，給予紅景天苷進行干預(yù)，觀察大鼠認知功能改善情況，并探討其潛在機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 動物、試劑與儀器

實驗動物：選擇18～20個月齡健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量450～500 g，購自中南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心，動物實驗許可證號為SCXK（湘）2008-0004，動物合格證編號為2007000577866。大鼠在SPF環(huán)境中自由進食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。所有實驗均按照國家衛(wèi)生研究院《實驗動物護理和使用指南》進行。

試藥：紅景天苷（西安飛達生物技術(shù)有限公司，純度＞95%）；異氟醚（魯南貝特制藥有限公司）；10%水合氯醛（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司）；IL-6，TNF-α和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；鼠抗CB2R及CD11b單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；鼠抗GADPH單克隆抗體和辣根過氧化物酶HRP標記山羊抗鼠IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）。

儀器：HBS-1096B型酶標儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）；Primo R型臺式冷凍離心機（德國Heraeus公司）；BD垂直電泳儀（美國BD公司）；EC 300型凝膠成像儀（美國UVP公司）；組織脫水機、包埋機、全自動輪轉(zhuǎn)切片機等病理配套設(shè)備（德國Leica公司）。

1．2 方法

1．2．1 分組及造模

將大鼠隨機均分為對照組、POCD組和紅景天苷組，各20只。所有大鼠均用3．0%異氟醚誘導(dǎo)麻醉，切開膝關(guān)節(jié)下皮膚，顯露脛骨，將0．3 mm針插入其髓腔內(nèi)，進行固定。除對照組外，其他組大鼠在脛骨中點處截斷骨頭。用無菌生理鹽水清洗傷口，縫合。待大鼠蘇醒后回籠。大鼠蘇醒后，紅景天苷組給予75 mg／kg紅景天苷灌胃，對照組和POCD組給予等量生理鹽水灌胃，持續(xù)到術(shù)后第7天。

1．2．2 曠場實驗

每組選10只大鼠，于術(shù)前1 d和術(shù)后1，7 d分別進行曠場實驗，評估大鼠自發(fā)活動能力。保持九宮格曠場箱處于弱光、安靜環(huán)境，將大鼠放入曠場箱中央，任其自由行動，采集大鼠5 min內(nèi)活動軌跡，用SuperMaze高通量動物行為實驗分析軟件計算觀測時間內(nèi)的運動距離。

1．2．3 恐懼實驗

每組選10只大鼠，于術(shù)前1 d進行恐懼條件反射訓(xùn)練。將大鼠放入實驗箱中接受聲音和足底刺激，以建立長期記憶。于術(shù)后1，7 d分別進行恐懼條件反射測試，記錄5 min內(nèi)大鼠僵直時間，用DigBehv動物行為分析系統(tǒng)記錄僵直時間百分比。

1．2．4 檢測指標測定

血清中IL-6，TNF-α，MCP-1含量：曠場實驗和恐懼實驗結(jié)束后，對大鼠進行心臟取血，分離血清，采用ELISA法檢測含量，嚴格按ELISA試劑盒說明書操作。

海馬組織中CB2R含量：大鼠處死后分離海馬組織，-80℃保存?zhèn)溆?。海馬組織（每組10只）用PIPA裂解液進行蛋白質(zhì)提取，采用BCA蛋白檢測試劑盒測定上清液中總蛋白濃度。用100℃沸水對蛋白進行預(yù)變性電泳，每孔上樣30μg，將印跡到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，加入鼠抗CB2R抗體（1∶1 000）和GADPH抗體（1∶10 000），4℃過夜，沖洗后，將膜與辣根過氧化物酶HRP標記山羊抗鼠IgG二抗（1∶10 000）在室溫下孵育30 min。用電化學(xué)發(fā)光（ECL）法顯色，采集圖像，用圖像分析軟件（AlphaEaseFC軟件）分析。

海馬組織中CD11b含量：海馬組織（每組10只）用福爾馬林固定，脫水，包埋，將蠟塊切成3μm厚切片，用5%牛血清白蛋白封閉20 min，磷酸鹽緩沖液洗滌，4℃下用鼠抗CD11b單克隆抗體（1∶2 000）孵育過夜。沖洗后，切片用FITC標記的山羊抗小鼠IgG二抗（1∶50）在室溫下黑暗中孵育2 h，洗滌后用熒光顯微鏡和成像系統(tǒng)對免疫染色切片進行觀察。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23．0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。實驗結(jié)果采用均數(shù)±標準差（X±s），行單因素方差分析，組間兩兩比較行SNK-q檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 曠場實驗探索總路程

3組各時點曠場實驗探索總路程比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。詳見表1。

表1 3組大鼠不同時點曠場實驗探索總路程比較（X±s，cm，n＝10）

2．2 恐懼測試僵直時間

與對照組相比，POCD組和紅景天苷組術(shù)后1 d場景恐懼測試僵直時間百分比降低（P＜0．05）；與POCD組相比，紅景天苷組術(shù)后7 d場景恐懼測試僵直時間百分比升高（P＜0．05）；3組各時點聲音恐懼測試僵直時間百分比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。詳見表2。

表2 3組大鼠不同時點恐懼測試僵直時間比較（X±s，%，n＝10）

2．3 各項檢測指標

與對照組相比，POCD組和紅景天苷組不同時點血清中IL-6，TNF-α，MCP-1，以及海馬組織中CB2R和CD11b含量均增加（P＜0．05）；與POCD組相比，紅景天苷組各檢測指標含量均降低（P＜0．05）。詳見表3及圖1至圖3。

圖1 3組大鼠不同時點海馬組織中CB2R含量比較

3 討論

神經(jīng)炎性與認知障礙的相關(guān)性在POCD的機制中尤為突出［9］。細胞因子IL-6和TNF-α被認為是與認知障礙相關(guān)的神經(jīng)炎性介質(zhì)［10］。最新研究表明，POCD小鼠MCP-1 mRNA表達增加［11］。本研究中觀察到術(shù)后大鼠血清中IL-6，TNF-α，MCP-1含量增加導(dǎo)致記憶障礙。有研究顯示，術(shù)后使用CB2R抑制劑JWH133可改善術(shù)后記憶喪失，減輕海馬和前額葉皮質(zhì)炎性因子水平升高，提示抑制CB2R可能對術(shù)后早期認知具有保護作用［12］。神經(jīng)病理學(xué)研究表明，CB2R的上調(diào)是針對人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不同類型慢性損傷的常見反應(yīng)，且小膠質(zhì)細胞中CB2R的選擇性存在，強烈表明該受體在疾病相關(guān)的神經(jīng)炎性過程中的重要作用［13］。CD11b是小膠質(zhì)細胞活化的標志物，對阿爾茨海默病的研究表明，CB2R通過抑制CD11b的活化減輕中樞炎性反應(yīng)［14］。本研究結(jié)果顯示，海馬依賴的認知功能在術(shù)后受損，神經(jīng)炎性反應(yīng)增強。因海馬依賴的學(xué)習和記憶極易受炎癥影響，只有當特定的潛在神經(jīng)內(nèi)通路，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）介導(dǎo)的通路受到顯著影響時，特定認知區(qū)域的功能障礙才會發(fā)生［15］?？梢酝茰y，神經(jīng)炎性反應(yīng)可能啟動了CB2R的上調(diào)，從而促進了神經(jīng)炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，CB2R的神經(jīng)保護作用可能是通過抑制小膠質(zhì)細胞活化和促炎細胞因子產(chǎn)生介導(dǎo)。

表3 3組大鼠不同時點各檢測指標含量比較（X±s，n＝10）

圖2 3組大鼠術(shù)后1 d海馬組織中CD11b含量比較（免疫熒光染色，×200）

圖3 3組大鼠術(shù)后7 d海馬組織中CD11b含量比較（免疫熒光染色，×200）

綜上所述，術(shù)后早期抑制CB2R對記憶有潛在保護作用。術(shù)后用紅景天苷治療可抑制神經(jīng)炎性，增強記憶。