土大黃對(duì)銀屑病小鼠皮膚組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1及神經(jīng)纖維蛋白-1表達(dá)的影響*

熱比姑麗·伊斯拉木，艾西木江·熱甫卡提，阿布都吉力力·阿布都艾尼，阿布都帕塔爾·阿布迪熱扎克，祖力皮卡爾·買買提，玉素甫江·艾力

（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆 烏魯木齊 830011）

土大黃RumexL．是蓼科Polyonaceae酸模屬Rumex植物，多年生草本，新疆維吾爾自治區(qū)南部區(qū)域農(nóng)村民間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，維吾爾族常用土大黃植物不同部位（根、莖、葉及全草）水煎煮液治療銀屑病等各種皮膚病，且療效較好。2013年至今，本課題組對(duì)該藥材進(jìn)行了顯微鑒別，以及抗炎免疫、治療銀屑病等一系列藥效學(xué)試驗(yàn)研究［1-4］，也通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了土大黃民間用藥的科學(xué)內(nèi)涵。本研究中采用咪喹莫特（IMQ）誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型，通過土大黃干預(yù)，檢測(cè)小鼠皮膚組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、神經(jīng)纖維蛋白-1（NRP-1）表達(dá)，旨在探討土大黃對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）免疫抑制功能的影響，為進(jìn)一步開發(fā)利用民間藥材提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 儀器、試藥與動(dòng)物

1．1．1 儀器

LEICA TP1020型生物組織脫水機(jī)、LEICA RM2235型切片機(jī)、LEICA DM4000型生物顯微鏡、LEICA LAS V4．5型顯微成像系統(tǒng)（德國(guó)萊卡公司）；KD-BMIII型生物組織包埋機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）；KZPG-1A型攤片烤片機(jī)（天津天利航空機(jī)電有限公司）；LOCUS型烤箱（廣東省中山市諾潔仕電氣有限公司）。

1．1．2 試藥

咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030128，批號(hào)為141201）；Silkee脫毛霜（美國(guó)Stella Jone′s Inc．公司授權(quán)生產(chǎn)，巴基斯坦制造）；醋酸地塞米松片（DXM，Dexametasone Acetate Tablet，浙江仙琚制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33020822，批號(hào)為140670，規(guī)格為每片0．75 mg）。TGF-β1（貨號(hào)為bs-0693R，批 號(hào) 為AE010840），NRP-1（貨 號(hào) 為bs-0086R，批號(hào)為909086），均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Tris／EDTA修復(fù)液（貨號(hào)為ZLI-9066，批號(hào)為WP143310），通用SP試劑盒（貨號(hào)為SP-9000，批號(hào)為WP142714），DAB kit 20（貨 號(hào) 為ZLI-9018，批 號(hào) 為K146909E），磷酸鹽緩沖液（PBS，貨號(hào)為ZLI-9062，批號(hào)為150511），均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二甲苯（批號(hào)為20150302），無水乙醇（批號(hào)為20150305），均購(gòu)自天津永晟精細(xì)化工有限公司。土大黃（批號(hào)為12110）由新疆華安中藥飲片有限責(zé)任公司提供，由新疆大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院努爾巴依·阿不都沙力克教授通過顯微鑒別鑒定為正品。

1．1．3 動(dòng)物

BALB／c小鼠，84只，雌性，SPF級(jí)，日齡42～70 d，由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（新）2011-0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所藥物安全性評(píng)價(jià)中心［GLP中心，SYXK＜新＞2011-0005］審核，符合新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)管理準(zhǔn)則。實(shí)驗(yàn)開始前檢疫，經(jīng)一般行為觀察，選用符合要求的80只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．2 方法

1．2．1 土大黃提取物制備

取適量土大黃根，用8倍量的70%乙醇室溫密閉浸泡1 h后回流提取3次，第1次回流2 h，第2次和第3次回流1．5 h，過濾，合并濾液減壓濃縮至浸膏狀，真空干燥，得干膏粉。

1．2．2 IMQ誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型建立［3-9］

將80只BALB／c小鼠分為2組，對(duì)照組12只，咪喹莫特誘導(dǎo)模型組68只。背部使用Silkee脫毛霜脫毛，背部涂抹面積約為2．0 cm×1．5 cm。對(duì)照組小鼠背部無毛區(qū)域每日涂抹凡士林，模型組小鼠涂抹以5%IMQ乳膏60 mg／d（有效藥物為3 mg／d），連續(xù)6 d。

1．2．3 動(dòng)物分組及給藥

造模成功后，選用符合要求的60只造模小鼠隨機(jī)分為模型組（給予IMQ），DXM（給予DXM 1．02 mg／kg），土大黃根提取物低、中、高劑量組［RE-L組（1 g／kg），RE-M組（2 g／kg），RE-H組（4 g／kg）］，各12只。各給藥組灌胃給予相應(yīng)藥物，灌胃容積均為每10 g體質(zhì)量0．2 mL，1次／日，對(duì)照組、模型組灌胃給予等體積的0．5%羧甲基纖維素鈉（0．5%CMC-Na），連續(xù)14 d。小鼠每周測(cè)1次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化隨時(shí)調(diào)整給藥劑量。

1．2．4 指標(biāo)檢測(cè)

1）試劑配制（臨用前配制）

PBS：取1 000 mL（1袋）溶于1 000 mL蒸餾水（1∶1）中，即得。Tris／EDTA修復(fù)液：取10 mL溶于500 mL蒸餾水中（1∶50），即得。DAB顯色劑：將1滴A液（約50μL）溶于1 000μL B液中（1∶200）?？贵w（TGF-β1）：取抗體加PBS，抗體∶PBS為1∶500。抗體（NRP-1）：取抗體加PBS，抗體∶PBS為1∶500。

2）石蠟切片制作

固定：在研究1中BALB／c小鼠，取背部皮膚組織固定于15%中性福爾馬林；取材：1．5 cm×1．5 cm，厚度不超過0．5 cm；脫水、浸蠟：分別經(jīng)80%乙醇，95%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明2次，浸蠟3次，均1 h；包埋：用液體石蠟；切片：0．3μm厚度切片。

3）免疫組織化學(xué)SP法

檢測(cè)皮膚TGF-β1和NRP-1表達(dá)。取上述石蠟切片放入60℃烤箱內(nèi)30 min，融化石蠟。從烤箱中取出后依次放入3份100%二甲苯中脫蠟，每份放置10 min。將脫蠟完畢的切片依次放入100%，95%，85%，75%乙醇中，每次3 min，最后用蒸餾水沖洗干凈，完成水化。將切片置入已配好的EDTA中，微波爐預(yù)熱1 min，調(diào)微波爐加熱檔中高10 min、高5 min進(jìn)行抗原修復(fù)。室溫冷卻20 min后，PBS清洗3遍，每次3 min。每張切片上滴1滴（約50μL）過氧化物酶阻斷劑，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS，每張切片上滴1滴（約50μL）正常非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育10 min。除去血清，每張切片上滴1滴（約50μL）一抗（TGF-β1），4℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min，NRP-1和TGF-β1同法。除去PBS，每張切片上滴1滴（約50μL）生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS，每張切片上滴1滴辣根過氧化物酶標(biāo)記物，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS，每張切片上滴2滴（約100μL）新鮮配制的DAB顯色劑，顯微鏡下觀察3～10 min。自來水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，PBS沖洗反藍(lán)。切片依次放入75%，85%，95%，100%乙醇中，每次3 min，脫水干燥，二甲苯透明，干性樹脂封片。

1．2．5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)［10-11］

以胞外或胞膜有棕黃色顆粒狀沉積為陽性。采用積分法判斷陽性表達(dá)結(jié)果，對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)分，將染色強(qiáng)度為無、弱、中、強(qiáng)分別計(jì)分為0～3分，再將陽性細(xì)胞比例以≤5%，16%～25%，26%～50%，51%～75%，＞75%分別計(jì)分為0～4分，最后綜合評(píng)分。

1．2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。計(jì)數(shù)資料采用Kruskal-walls H，Mann-whitneyU非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行多組樣品比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 對(duì)IMQ誘導(dǎo)銀屑病模型TGF-β1表達(dá)的影響

TGF-β1細(xì)胞定位細(xì)胞外基質(zhì)，以胞外棕黃色顆粒狀沉積為陽性。與對(duì)照組小鼠背部皮膚比較，IMQ誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型組小鼠背部皮膚TGF-β1表達(dá)弱或低表達(dá)（Z＝-2．673，P＜0．01）。與IMQ誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型組比較，RE-M組小鼠背部皮膚TGF-β1表達(dá)升高或增強(qiáng)（Z＝-2．673，P＜0．01）。雖DXM組、RE-L組、RE-H組表達(dá)升高或增強(qiáng)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝-1．263，-1．114，-0．191，P＞0．05）。結(jié)果見圖1。

2．2 對(duì)IMQ誘導(dǎo)銀屑病模型NRP-1表達(dá)的影響

NRP-1細(xì)胞定位細(xì)胞膜，以胞膜有棕黃色顆粒狀沉積為陽性。與對(duì)照組小鼠背部皮膚比較，模型組小鼠背部皮膚NRP-1表達(dá)弱或低表達(dá)（Z＝-2．309，P＜0．05）；與模型組比較，DXM組小鼠背部皮膚NRP-1表達(dá)升高或增強(qiáng)（Z＝-2．018，P＜0．05），RE-M組和RE-H組表達(dá)升高或增強(qiáng)（Z＝-2．439，-2．309，P＜0．05）；雖RE-L組表達(dá)升高或增強(qiáng)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝-1．300，P＞0．05）。結(jié)果見圖2。

3 討論

銀屑病的觸發(fā)因素和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為其是一種多基因遺傳背景下的免疫性疾病，其中T淋巴細(xì)胞免疫功能的紊亂是發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，且與皮損的發(fā)生、發(fā)展和持續(xù)存在密切相關(guān)。Treg細(xì)胞是維持機(jī)體免疫耐受的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞，能選擇性地抑制一些效應(yīng)性T細(xì)胞（Th17細(xì)胞）和自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化，主要通過細(xì)胞接觸機(jī)制或抑制性細(xì)胞因子TGF-β1發(fā)揮主動(dòng)免疫抑制作用［12-14］。尋常型銀屑病患者局部皮損組織中Th17細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)，Treg細(xì)胞的免疫抑制功能減弱，證實(shí)了在尋常型銀屑病局部皮損組織中存在Th17／Treg細(xì)胞的失衡［15-17］。表明銀屑病的發(fā)病與效應(yīng)性T細(xì)胞和自身反應(yīng)性T細(xì)胞的持續(xù)激活，缺乏有效的免疫抑制機(jī)制有關(guān)，提示銀屑病患者機(jī)體可能存在Treg細(xì)胞數(shù)量減少或功能障礙。通過抑制Th17細(xì)胞的活化及其細(xì)胞因子的表達(dá)，適當(dāng)上調(diào)Treg細(xì)胞免疫功能，有助于銀屑病的轉(zhuǎn)歸。

圖1 土大黃提取物對(duì)IMQ誘導(dǎo)銀屑病模型TGF-β1表達(dá)的影響（背部皮膚，×400）

圖2 土大黃提取物對(duì)IMQ誘導(dǎo)銀屑病模型NRP-1表達(dá)的影響（背部皮膚，×400）

CD4＋CD25＋Treg是目前研究得較多的一種亞型，其數(shù)量和功能異常是人類和動(dòng)物自身免疫性疾病和其他炎性疾病的重要原因，其分子表面表達(dá)TGF-β1、白細(xì)胞介素10（IL-10）、NRP-1等膜分子，具有免疫抑制和免疫無能作用。研究表明，CD4＋CD25＋Teg通過膜相關(guān)TGF-β1發(fā)揮免疫抑制功能，Nrp-1能增強(qiáng)其共同表達(dá)的TGF-β1，從而起到免疫抑制作用［12-17］。銀屑病外周血和從皮損分離的CD4＋CD25＋Treg的抑制能力均減弱，而反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖活性過強(qiáng)［18-23］，提示Treg的抑制作用減弱使致病的T細(xì)胞增生，可能導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)。

本研究中TGF-β1檢測(cè)結(jié)果表明，小鼠局部皮損組織Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能降低，導(dǎo)致局部皮膚組織Th17／Treg細(xì)胞失衡，導(dǎo)致引起銀屑病表皮免疫功能紊亂。與模型組比較，RE-M組TGF-β1表達(dá)升高或增強(qiáng)，表明RE-M能使局部皮膚組織Treg細(xì)胞免疫向上調(diào)節(jié)，使得恢復(fù)局部皮膚組織Th17／Treg細(xì)胞失衡，改善銀屑病表皮免疫功能紊亂。雖然DXM組、RE-L組、RE-H組能使TGF-β1表達(dá)升高或增強(qiáng)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），提示上述藥物對(duì)小鼠局部皮損組織Treg細(xì)胞功能調(diào)節(jié)無明顯影響。NRP-1檢測(cè)結(jié)果表明，小鼠局部皮損組織Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能降低，導(dǎo)致局部皮膚組織Th17／Treg細(xì)胞失衡，以引起銀屑病表皮免疫功能紊亂。與模型組比較，DXM組、RE-M組、RE-H組均能使NRP-1表達(dá)升高或增強(qiáng)（P＜0．05），提示上述藥物均能使局部皮膚組織Treg細(xì)胞免疫向上調(diào)節(jié)，使得恢復(fù)局部皮膚組織Th17／Treg細(xì)胞失衡，能改善銀屑病表皮免疫功能紊亂。RE-L組NRP-1差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），提示上述藥物對(duì)小鼠局部皮損組織Treg細(xì)胞功能調(diào)節(jié)無明顯影響。

綜上所述，IMQ誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型皮損中存在Th17／Treg細(xì)胞失衡，引起IL-23／IL-17軸失衡，效應(yīng)性T細(xì)胞功能活躍，Treg細(xì)胞免疫抑制功能減弱，最終導(dǎo)致免疫功能紊亂而引起疾病。通過土大黃干預(yù)能使小鼠背部皮膚組織TGF-β1和NRP-1表達(dá)升高，表明土大黃提取物能促進(jìn)或增強(qiáng)Treg細(xì)胞功能，抑制效應(yīng)性T細(xì)胞和自身反應(yīng)性T細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)，恢復(fù)Th17／Treg細(xì)胞失衡，調(diào)節(jié)IMQ誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型IL-23／IL-17軸，從而改善銀屑病表皮免疫功能紊亂，具有抗銀屑病作用［12-23］。