UPLC-MS/MS測定野拔子蜂蜜中氯霉素殘留*

尚遠(yuǎn)宏，田金鳳，孫卓然

(1 攀枝花學(xué)院，四川 攀枝花 617000；2 呼和浩特市疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070)

野拔子，別名野巴子[1]、野壩子[2]，為唇形科植物野拔子ElsholtziarugulosaHemsl.的干燥帶嫩枝的葉，為中國西南地區(qū)主要的秋、冬蜜源植物[3]，并含有黃酮類化合物[4-6]和揮發(fā)性成分[7]。野拔子蜂蜜被稱為“金牌蜜”，屬于天然營養(yǎng)佳品，受到了很多人的青睞，為蜜中上品[8]，花期在10月下旬至12月上旬，主要開花流蜜期30～40天[9]。

氯霉素屬抑菌性廣譜抗生素，人體食入動(dòng)物性食品中的殘留對其造血系統(tǒng)存在著嚴(yán)重不良反應(yīng)[10-11]。國家早在2002年將氯霉素列為禁用藥物，現(xiàn)行行標(biāo)NY 5030-2016《無公害農(nóng)產(chǎn)品獸藥使用準(zhǔn)則》中規(guī)定，在動(dòng)物性食品中不得檢出。

目前，測定抗生素殘留量的方法較多[12-13]，但高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是測定抗生素殘留量方法中最為通用的檢測手段[14-17]，具有準(zhǔn)確、高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。本文采用液質(zhì)聯(lián)用法對野拔子蜂蜜中氯霉素殘留量進(jìn)行了測定，對目標(biāo)分析物的同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析，該方法可滿足日常檢測的需要。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器和試劑

MCS復(fù)合型固相萃取柱(500 mg/6 mL)；電子天平，上海越平公司；Agilent 6460A超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；超純水器，美國Millipore公司；離心機(jī)，Sigma公司；渦旋混合器，LMS公司；氮吹儀，美國Organomation公司。

乙酸乙酯、甲醇、鹽酸、氨水、乙腈(色譜純)，F(xiàn)isher公司；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(CAS：56-75-7)，購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；D5-氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(CAS：202480-68-0)，購自美國Cambridge Isotope Laboratories；樣品為云南和四川市售不同廠家的野拔子蜂蜜商品。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取0.0250 g氯霉素、D5-氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解并定容至25 mL，濃度均為1.0 mg/mL，-20 ℃避光保存。其它濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇定量稀釋即得。

1.2.2 樣品前處理

樣品處理參照文獻(xiàn)[18]方法，稱取野拔子蜂蜜5.00 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入100 μL D5-氯霉素內(nèi)標(biāo)液和水10 mL混勻溶解，再經(jīng)10 mL乙酸乙酯超聲提取5 min后，離心3 min(3000 r/min)，取上清液于50 ℃氮?dú)庀麓蹈伞７謩e在加入0.1 mL甲醇和1.9 mL 40 mmol/L鹽酸溶液超聲溶解1 min，高速離心2 min(10000 r/min)，取上清液于MCS復(fù)合型固相萃取柱過柱，用5 mL水淋洗除雜真空抽干，再加入5 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液于50 ℃氮?dú)庀麓蹈桑錃埩粑锛?.1 mL甲醇超聲溶解后，再加入0.9 mL 10%甲醇水溶液混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過后，即得。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；測流動(dòng)相：0.05%的氨水溶液-乙腈；流速：0.2；進(jìn)樣體積：5 μL；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序：0～1 min，10%乙腈；1～4 min，90%乙腈；4～4.1 min，10%乙腈；4.1～5 min，10%乙腈。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；掃描方式：氯霉素、D5-氯霉素為正離子掃描；干燥氣流量：10 L/min；霧化器壓力：35 psi；毛細(xì)管電壓：3500 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取與凈化

農(nóng)藥殘留分析的關(guān)鍵是樣品前處理，野拔子蜂蜜中含有大量的葡萄糖、果糖、有機(jī)酸等組分，對藥物的干擾很大，因此，必須進(jìn)行樣品前處理。樣品處理前，需要考慮待測藥物的濃度范圍、理化性質(zhì)、測定目的及選用的生物體液和組織的類型等。氯霉素易溶于乙酸乙酯，選用乙酸乙酯提取樣品的氯霉素有很高的提取效率，同時(shí)選擇MCS復(fù)合型固相小柱，填料為硅膠和陽離子交換樹脂，回收率均在90%以上，對野拔子蜂蜜中氯霉素的測定可起到良好的凈化效果。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜分析參數(shù)

注：*為定量離子。

2.3 線性關(guān)系及檢出限

向空白野拔子蜂蜜基質(zhì)溶液中加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，分別制備成氯霉素含量0.1 ng/mL、0.25 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL，以峰面積對應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸，其線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)>0.999，結(jié)果見表2。

表2 氯霉素線性回歸方程、檢出限和相關(guān)系數(shù)

注：根據(jù)信噪比S/N=3和S/N=10計(jì)算檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

2.4 回收率與精密度

選擇空白樣品(陰性的野拔子蜂蜜樣品)進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)，樣品分別添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液各6份，搖勻、靜置20 min后按“1.2.2方法”處理分析。平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果見表3，由表3可見，各添加水平的回收率為93.7%～99.3%，方法的準(zhǔn)確度與精密度均滿足氯霉素分析的要求。圖1為加標(biāo)樣品的MRM色譜圖。

表3 氯霉素加標(biāo)回收率及精密度(n=6)

圖1 加標(biāo)(2.0 μg/kg)樣品的MRM色譜圖

3 結(jié) 論

野拔子蜂蜜作為市場流通的蜂蜜產(chǎn)品，其抗生素殘留也引起越來越多的關(guān)注，同時(shí)蜂蜜中的氯霉素早已列為國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測項(xiàng)目[19]，就有必要對野拔子蜂蜜的氯霉素殘留進(jìn)行檢測。本文采用內(nèi)標(biāo)法定量，液質(zhì)聯(lián)用法測定市售的野拔子蜂蜜中氯霉素的殘留量均未檢出，且方法靈敏度較好，回收率和重現(xiàn)性符合檢測要求，達(dá)到了氯霉素殘留分析的要求, 可用于食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測野拔子蜂蜜樣品的測定，減少防治蜂群疾病時(shí)對氯霉素的依賴，保證野拔子蜂蜜質(zhì)量安全提供了依據(jù)。