非酒精性脂肪性肝病患者腸道菌群與胰高血糖素樣肽1的相關性分析

劉志平，趙致維，張金華

武漢市漢口醫院 消化內科，武漢 430012

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發病率逐年攀升，已成為全球重要的公共衛生問題。胰島素抵抗(IR)、氧化應激、炎癥和遺傳傾向等多個因素參與了NAFLD的發生和發展，NAFLD與2型糖尿病、肥胖、血脂紊亂等多種代謝性疾病存在密切相關性[1]。研究[2-3]發現，應用胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide, GLP)1類似物艾塞那肽治療肥胖性2型糖尿病患者的同時，還可以降低患者肝細胞的脂質含量。動物實驗[4]亦發現，GLP-1類似物利那魯肽可以減輕高脂飲食誘導的NAFLD大鼠肝臟中的氧化應激及炎癥反應水平。近年來關于腸道菌群失調與2型糖尿病、NAFLD的研究逐漸成為熱點，GLP-1作為一種腸促胰素，被發現與腸道菌群之間亦存在千絲萬縷的聯系。對無菌小鼠進行糞菌移植后可減少其胃腸道GLP-1受體的表達并促進胃腸道蠕動，提示腸道菌群可能影響GLP-1生物學作用的發揮[5]。然而腸道菌群是否對GLP-1的分泌水平存在直接的影響尚不清楚。本研究通過觀察NAFLD患者血清GLP-1水平及腸道菌群的變化，探討NAFLD患者血清GLP-1水平的變化及其與腸道菌群失調之間的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年1月-2018年12月期間在本院就診的NAFLD患者116例，NAFLD診斷標準參照《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》[6]。排除標準：合并酒精性肝病者、病毒性肝炎者、自身免疫性肝病者、肝豆狀核變性者、藥物性肝病者；合并嚴重高血壓者；合并明確的糖尿病者；合并嚴重心、腎功能不全者；合并肝臟惡性腫瘤、感染或膽道疾病者；所有病因不能確定的肝功能異常者。另外選取在本院體檢的96例健康體檢者作為對照組。本研究方案經由武漢市漢口醫院倫理委員會審批(批號：2018022601)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 資料收集及指標檢測 收集所有患者的性別、年齡、既往病史等臨床資料，安排專人測量其身高、體質量，并計算BMI。所有受試者禁食10 h后于次晨抽取靜脈血標本，采用全自動生化分析儀檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)指標。空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)測定采用氧化酶法；血清空腹胰島素(fasting insulin, FINS)檢測采用電化學發光法(試劑盒產自德國羅氏公司)；血清GLP-l測定采用酶聯免疫吸附法(試劑盒產自美國R&D公司)。穩態模型計算胰島素抵抗指數:HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FINS(mIU/L)/22.5。

1.3 腸道菌群檢測 采集所有患者的新鮮糞便標本1.0 g左右置入無菌密閉便盒送檢。取糞便標本0.1 g加入裝有0.9 ml生理鹽水的無菌試管內，按連續10倍稀釋法稀釋后分別接種于不同的培養基上。腸桿菌、腸球菌和葡萄球菌等需氧菌置于37 ℃普通培養箱培養48 h；雙歧桿菌、乳酸桿菌和擬桿菌置于37 ℃厭氧培養箱中培養72 h。觀察培養結果，計數以每克濕糞中菌落形成單位的對數值表示(log cfu/g)。同時計算雙歧桿菌與腸桿菌數值之比(B/E比值)評估腸道菌群定植抗力。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗；計數資料2組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析和偏相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 NAFLD組BMI、TG、TC、LDL-C、FINS、HOMA-IR水平高于對照組，而血清GLP-1水平低于對照組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表1)。

表1 2組一般資料及生化指標比較

2.2 腸道菌群數量及B/E比值比較 與對照組比較，NAFLD組雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌數量及B/E比值降低，而腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌數量則顯著升高，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 2組腸道細菌數量及B/E值比較

2.3 血清GLP-1水平的影響因素分析 Pearson相關分析顯示，血清GLP-1水平與B/E比值呈正相關(r=0.604，P=0.008)，而與BMI(r=-0.551，P=0.013)、TG(r=-0.424，P=0.035)、TC(r=-0.386，P=0.041)、LDL-C(r=-0.445，P=0.011)、HOMA-IR(r=-0.503，P=0.021)呈負相關。控制BMI、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR等因素后，GLP-1與B/E比值仍然呈正相關(r=0.576，P=0.015)。

3 討論

NAFLD病理特征表現為肝臟脂肪含量增多、彌漫性肝細胞脂肪變，它不僅導致肝臟的損害，還與IR、糖尿病、肥胖、血脂紊亂等代謝綜合征存在明顯的相關性，被認為是代謝綜合征在肝臟的表現。近年來相關研究發現，腸-肝軸在NAFLD的發生、發展中起重要作用。目前已知腸道菌群作為一個復雜的生態系統，其數量龐大、品種繁多，某些種類細菌對人體是有益的，而某些種類的細菌卻影響身體健康，還有一些種類的細菌目前作用尚不明確。在腸道內這些細菌按一定比例組合成一個平衡的微生態系統，在維持腸道內環境的穩定中起到了至關重要的作用。不論是動物實驗還是人體研究均發現，腸道菌群失調與NAFLD的發生和發展均存在密切相關性[7]。與正常人群相比，肥胖和NAFLD患者，不同種類的腸道細菌在數量上有著顯著差異，而且限制脂肪的飲食方式可以改變腸道菌群的數量[8]。本研究中亦有相似的發現，NAFLD患者與健康人群相比，雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌數量降低，而腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌數量則顯著升高。Boursier等[9]發現NAFLD患者中，腸道菌群數量的變化與非酒精性脂肪性肝炎及肝臟纖維化評分之間存在顯著的相關性。動物實驗[10]發現，高脂飲食喂養的小鼠中，腸道優勢菌群為厚壁桿菌的小鼠出現了血糖升高與炎性因子增加，而將其盲腸內細菌接種到高脂飲食的無菌小鼠體內后則發現，小鼠肝細胞TG沉積嚴重，肝細胞出現明顯脂肪變性。總而言之，目前有充分的證據表明，腸道菌群失調與NAFLD存在密切關聯。而且進一步的研究發現，補充腸道益生菌制劑能夠緩解NAFLD病情。一項針對NAFLD兒童患者進行的雙盲隨機臨床試驗[11]發現，服用VSL#3(益生菌制劑)可有效改善兒童NAFLD病情。王薇等[12]發現，以雙歧三聯活菌、枯草桿菌腸球菌二聯活菌等益生菌治療NAFLD患者，在改善NAFLD患者腸道微生態失衡的同時，還能降低血清TNFα水平，提升脂聯素水平，降低血糖、血脂及轉氨酶水平，減輕脂肪肝病變程度。因此，腸道菌群在NAFLD的發生和發展中扮演著重要的角色，腸道菌群失調參與NAFLD的機制可能涉及肝臟能量代謝及炎癥因子激活等多條途徑，目前尚有待進一步研究。

GLP-1是由位于腸道的L細胞分泌的一種強效腸促胰素，GLP-1依賴血糖水平調節胰島素分泌，在改善血糖的同時又能防止低血糖的發生，在維持機體血糖穩定中發揮著至關重要的作用[13]。近年來，臨床上GLP-1類似物已經被廣泛用于2型糖尿病的治療，不僅在控制血糖方面獲得了良好的效果，還可以減輕體質量、改善血脂代謝紊亂。不僅如此，越來越多的研究發現，GLP-1在治療2型糖尿病的同時，還可以緩解NAFLD。侯洪濤等[14]研究發現，GLP-1類似物利拉魯肽可能通過下調肝組織細胞因子信號轉導抑制因子3和固醇調節元件結合蛋白-1C的mRNA表達，改善高脂飼料喂養的SD大鼠的IR，減少肝臟TG沉積。本研究發現，NAFLD患者血清GLP-1水平降低，而且與BMI、TG、TC、LDL-C及IR存在負相關，提示內源性GLP-1水平不足與體質量增加、血脂代謝紊亂及IR等多個NAFLD危險因素存在關聯。這一結果為GLP-1緩解NAFLD的相關理論[15]提供了進一步的依據。近年來關于腸道菌群與GLP-1的關系開始逐漸受到關注。目前已有研究[16]發現，腸道細菌的代謝產物短鏈脂肪酸、次級膽汁酸等可能參與了調控腸道L細胞分泌GLP-1，另外腸道菌群失調還可能與GLP-1抵抗有關。本研究對比了NAFLD組與健康對照組之后發現，NAFLD組存在雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌數量及B/E比值降低，而腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌數量則顯著高于健康對照組，而且血清GLP-1水平與B/E比值之間存在正相關，提示GLP-1水平降低與腸道菌群失調有關。因此，腸道菌群對GLP-1的影響可能涉及多條途徑，不僅能調控其分泌，還可能影響其生物學效應的發揮。

總之，NAFLD患者體質量增加、血脂紊亂及IR可能與腸道GLP-1分泌不足有關，而腸道菌群紊亂可能通過某些尚不明確的途徑參與了GLP-1的分泌調控過程。進一步研究腸道菌群相關代謝產物影響腸道L細胞GLP-1分泌的具體機制，將有助于明確腸道菌群參與NAFLD發生和發展的相關途徑，為臨床應用益生菌防治NAFLD提供更多的理論依據和治療措施。