HEV核酸、抗原、抗體對(duì)HEV感染的診斷價(jià)值

李曉鶴，王江華，季 穎，劉 艷，朱 凌，賈玉緣，王震宇，史羿君，張海瑩，饒慧瑛

北京大學(xué)人民醫(yī)院 北京大學(xué)肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044

戊型肝炎是一種世界范圍流行的嚴(yán)重威脅人類健康的腸道傳染病[1-2]。全球每年新發(fā)戊型肝炎約330萬(wàn)例，其中死亡約4.4萬(wàn)人，并可導(dǎo)致約5200例孕婦流產(chǎn)。我國(guó)是戊型肝炎的高流行區(qū)之一，曾多次爆發(fā)戊型肝炎，人群發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[3]。戊型肝炎雖為急性自限性疾病，但其病死率高于甲型肝炎和乙型肝炎，在我國(guó)成年人急性病毒性肝炎中占首位[4]。糞-口途徑傳播是其主要傳播方式，亦見(jiàn)于輸血和垂直傳播，主要表現(xiàn)為急性肝功能損害，易發(fā)展為肝衰竭，病死率很高[5]。戊型肝炎包括4個(gè)主要的基因型，我國(guó)流行的病毒株主要是基因4型[6-7]。近年來(lái)，上海、浙江等地的豬群中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)HEV 3感染[8]。目前戊型肝炎的實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括HEV核酸(HEV RNA)檢測(cè)、HEV IgM抗體和HEV IgG抗體檢測(cè)[7]。研究[9-11]報(bào)導(dǎo)了不同HEV IgM抗體檢測(cè)試劑靈敏度不一致，而且特異度差，并且皰疹病毒感染會(huì)導(dǎo)致HEV IgM抗體檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性[12]；目前，關(guān)于HEV RNA和HEV抗原(HEV Ag)在臨床診斷HEV感染中作用的研究很少，因此，本研究將分析HEV抗體陽(yáng)性標(biāo)本中HEV RNA、HEV Ag的陽(yáng)性率及基因型檢出情況，同時(shí)對(duì)生化指標(biāo)進(jìn)行分析，并進(jìn)一步研究抗體對(duì)HEV Ag檢測(cè)影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2015年5月-2019年4月在北京大學(xué)人民醫(yī)院進(jìn)行HEV IgM抗體和HEV IgG抗體檢測(cè)的標(biāo)本共13 992例。排除合并HBV感染、HCV感染的患者。所有血清標(biāo)本分裝后-80 ℃冷凍備用。本研究方案通過(guò)北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：RDY2016-13)。

1.2 HEV IgM抗體、HEV IgG抗體、HEV Ag檢測(cè) 北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司HEV IgM抗體(批號(hào)：EM20190502A)、HEV IgG抗體(批號(hào)：EG20190502A)、HEV Ag(批號(hào)：EV20181204)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm。陽(yáng)性對(duì)照吸光度(OD)值平均值≥0.80，陰性對(duì)照OD值平均值≤0.10，依據(jù)臨界值(S/CO值)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定，若樣本的OD值<臨界值，則判斷HEV IgM抗體、HEV IgG抗體、HEV Ag陰性，若檢測(cè)樣本的OD值≥臨界值，則判斷HEV IgM抗體、HEV IgG抗體、HEV Ag陽(yáng)性。HEV IgM抗體(萬(wàn)泰)樣本臨界值=0.26+3次陰性質(zhì)控平均值，HEV IgG 抗體(萬(wàn)泰)樣本臨界值=0.16+3次陰性質(zhì)控平均值,HEV Ag(萬(wàn)泰) 樣本臨界值=0.12+3次陰性質(zhì)控平均值。

1.3 HEV RNA檢測(cè) 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑提取HEV RNA，每次需140 μl血清，50 μl洗脫液進(jìn)行洗脫。HEV RNA擴(kuò)增檢測(cè)使用北京金豪制藥生物有限公司試劑盒(批號(hào)：20190603002)，反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min; 95 ℃ 15 s, 50 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min,5 cycles；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，40 cycles;檢測(cè)靈敏度1.0×103拷貝/ml，HEV PCR反應(yīng)液 20 μl，HEV Taq酶0.6 μl，HEV 逆轉(zhuǎn)錄酶0.2 μl，配套儀器為瑞士羅氏公司的Light Cycler熒光定量PCR儀。

1.4 HEV 序列分析 HEV上游引物序列為5′-CGGTGGTTTCTGGGGTGA-3′，HEV下游引物序列為5′-GCGAAGGGGTTGGTTGGA-3′，巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行序列分析。

1.5 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) AST、ALT、TBil、DBil水平采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，參考范圍分別為9～50 U/L、15～40 U/L、3～21 μmol/L、0～7 μmol/L。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用中位數(shù)(最小值～最大值)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 13 992例標(biāo)本中HEV IgM抗體或HEV IgG抗體檢測(cè)陽(yáng)性的血清標(biāo)本共1924例(單純HEV IgM抗體陽(yáng)性標(biāo)本27例、單純HEV IgG抗體陽(yáng)性標(biāo)本1772例、HEV IgM抗體和HEV IgG抗體同時(shí)陽(yáng)性標(biāo)本125例)，其中HEV IgM抗體陽(yáng)性152例(7.9%)，HEV IgG抗體陽(yáng)性1897例(98.6%)。1924例中男1123例，女801例，年齡45(11～88)歲，ALT 156.4(12.0～4501.0)U/L，AST 187.5(16.0～2587.0) U/L，TBil 32.5(3.8～484.0) mol/L，DBil 22.8(0.8～318.0) mol/L。HEV IgM抗體且HEV IgG抗體檢測(cè)陰性的血清標(biāo)本共12 068例(丙型肝炎13例、乙型肝炎69例、血液系統(tǒng)疾病4896例、自身免疫病34例、其他未明確診斷如轉(zhuǎn)氨酶升高等7056例，且HEV RNA均陰性)。

2.2 HEV RNA陽(yáng)性率 1924例HEV IgM抗體或HEV IgG抗體陽(yáng)性患者中HEV RNA陽(yáng)性62例(3.2%)。152例HEV IgM抗體陽(yáng)性患者的HEV RNA陽(yáng)性率為40.8%(62/152)；1897例HEV IgG抗體陽(yáng)性患者的HEV RNA陽(yáng)性率為3.0%(57/1897)(表1)。

表1 HEV RNA在HEV IgM抗體和HEV IgG抗體中的檢出情況

2.3 HEV Ag陽(yáng)性率 1924例HEV IgM抗體或HEV IgG抗體陽(yáng)性患者中HEV Ag陽(yáng)性55例(2.9%)。HEV RNA陽(yáng)性組中HEV Ag陽(yáng)性率為88.7%(55/62)；HEV IgM抗體陽(yáng)性組中，HEV Ag陽(yáng)性率為36.2%(55/152)；HEV IgG抗體陽(yáng)性組中HEV Ag陽(yáng)性率為2.6%(50/1897)(表2)。

表2 HEV Ag在HEV RNA和HEV IgM抗體中的檢出情況

2.4 肝功能指標(biāo)與HEV RNA、HEV Ag的關(guān)系 將152例HEV IgM抗體陽(yáng)性患者分為HEV RNA陽(yáng)性組和HEV RNA陰性組，陽(yáng)性組ALT、AST、TBil、DBil水平明顯高于陰性組(P值均<0.001)。152例HEV IgM抗體陽(yáng)性患者分為HEV Ag陽(yáng)性組和HEV Ag 陰性組，陽(yáng)性組ALT、AST、TBil、DBil水平明顯高于陰性組(P值均<0.001)(表3)。

2.5 HEV序列分析 熒光定量PCR結(jié)果顯示，HEV RNA陽(yáng)性62例標(biāo)本；巢式PCR擴(kuò)增測(cè)序檢測(cè)結(jié)果顯示，HEV RNA陽(yáng)性58例標(biāo)本，4例陰性(HEV RNA病毒載量低，PCR擴(kuò)增條帶弱)(圖1)。58例經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)HEV 基因型均為4型，未見(jiàn)報(bào)道中提到的3型和1型。

圖11～9號(hào)HEVRNA陽(yáng)性樣本PCR電泳圖

2.6 HEV IgG抗體對(duì)HEV Ag檢測(cè)結(jié)果的影響 為了檢測(cè)HEV IgG抗體對(duì)HEV Ag測(cè)定的影響，5例HEV基因4型的HEV IgG抗體陰性且HEV Ag陽(yáng)性的血清樣本中4例(另1例由于血清不足，未行下一步研究)用HEV RNA、HEV IgM抗體和HEV IgG抗體均陰性血漿連續(xù)2倍稀釋(稀釋倍數(shù)分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32)，將4個(gè)系列稀釋樣本分別加入到HEV Ag陰性且HEV IgG抗體陰性的血清和HEV Ag陰性且HEV IgG抗體陽(yáng)性血清中。HEV Ag試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，與混合有HEV Ag陰性且HEV IgG抗體陰性血清的樣品相比，混合有HEV Ag陰性且HEV IgG抗體陽(yáng)性血清樣本的HEV Ag S/CO值明顯降低，甚至出現(xiàn)陰性結(jié)果(圖2，表4)。

圖2 HEV IgG抗體對(duì)HEV Ag檢測(cè)結(jié)果的影響

表3 肝功能指標(biāo)和戊型肝炎標(biāo)志物的關(guān)系

表4 4例系列稀釋樣本的HEV Ag S/CO值

注：HEV IgM抗體樣本臨界值為0.269; HEV IgG抗體樣本臨界值為0.178; HEV Ag樣本臨界值為0.134。

3 討論

戊型肝炎的診斷主要依賴于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，在我國(guó)臨床中，急性戊型肝炎診斷率與實(shí)際感染率存在嚴(yán)重不符的現(xiàn)象，主要由于戊型肝炎實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的落后。在戊型肝炎潛伏期及疾病早中期，患者糞便和血清中常可檢出HEV RNA，早于臨床癥狀出現(xiàn)，是急性戊型肝炎確診的金標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)病后HEV RNA在血液中持續(xù)檢測(cè)至6～7周，但傳統(tǒng)的HEV IgM抗體試劑的特異度較差，急性病毒感染、類風(fēng)濕因子等標(biāo)本容易造成檢測(cè)假陽(yáng)性[12]。因此，現(xiàn)有的HEV IgM抗體診斷試劑還不能滿足臨床需求。而HEV IgG抗體這一指標(biāo)的缺陷依然十分突出，許多患者康復(fù)后HEV IgG抗體可以持續(xù)超過(guò)10年，并且在健康人群中也可檢出，無(wú)法區(qū)分急性感染和既往感染。這些缺陷造成臨床上誤診和漏診十分常見(jiàn)。熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)，具有較高的靈敏度和特異度，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可以在疾病的窗口期檢出HEV。目前，由于HEV RNA檢測(cè)方法復(fù)雜，對(duì)人員要求高等方法學(xué)的限制，北京地區(qū)開(kāi)展HEV RNA檢測(cè)的醫(yī)院非常少。

本研究發(fā)現(xiàn)，HEV IgM抗體陽(yáng)性組中HEV RNA陽(yáng)性率為40.8%(62/152)，HEV Ag陽(yáng)性率為36.2%(55/152)，HEV RNA陽(yáng)性組中HEV Ag陽(yáng)性率為88.7%(55/62)，HEV Ag與HEV RNA檢出的一致性很好。HEV RNA陰性組中HEV IgM抗體陽(yáng)性的患者90例，同時(shí)這部分患者的轉(zhuǎn)氨酶水平均值為141.6 U/L，表明這部分患者HEV IgM抗體可能是假陽(yáng)性結(jié)果，因此開(kāi)展戊型肝炎的核酸和抗原檢測(cè)尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)62例HEV RNA陽(yáng)性的患者，58例經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)HEV 基因型均為4型，未見(jiàn)報(bào)道中提到的3型和1型，與Wang等[13]報(bào)道相近，在我國(guó)豬群中發(fā)現(xiàn)基因3型感染，但至今我國(guó)仍未有人類感染基因3型的報(bào)道[8]。1924例患者中1840例HEV RNA陰性/HEV IgG抗體陽(yáng)性的患者，表明存在HEV的既往感染，進(jìn)一步說(shuō)明HEV IgG抗體無(wú)法區(qū)分既往感染和急性感染。另外，本研究發(fā)現(xiàn)在HEV RNA陽(yáng)性的人群中AST、ALT、TBil、DBil水平都明顯高于HEV RNA陰性人群，因此如果HEV IgM抗體陽(yáng)性，并同時(shí)伴轉(zhuǎn)氨酶高水平、膽紅素水平升高，具有一定輔助診斷戊型肝炎的作用,另有研究[14]報(bào)道62例HEV IgM抗體陽(yáng)性組AST、ALT、DBil和TBil水平升高，但由于HEV RNA只有16例，沒(méi)有比較HEV RNA陽(yáng)性組和陰性組生化指標(biāo)的區(qū)別。本研究發(fā)現(xiàn)HEV IgG抗體陽(yáng)性高水平會(huì)降低HEV Ag檢測(cè)的S/CO值，甚至轉(zhuǎn)變成陰性結(jié)果，因此，當(dāng)HEV IgG抗體高水平陽(yáng)性時(shí)，如果HEV Ag檢測(cè)的S/CO值陰性，要注意是否HEV IgG抗體抑制了HEV Ag檢出。

綜上所述，HEV Ag是HEV診斷的新標(biāo)志物，對(duì)戊型肝炎的臨床診斷具有一定的價(jià)值，而HEV IgM抗體陽(yáng)性、轉(zhuǎn)氨酶或膽紅素高水平對(duì)戊型肝炎具有輔助診斷的作用。