長時間近冰點溫度貯藏對杏果實貨架品質的影響

劉幫迪，范新光，舒 暢，王曉梅，曹建康，姜微波,

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.農業農村部規劃設計研究院，北京 100125；3.農業農村部農產品產后處理重點實驗室，北京 100121）

杏樹廣泛種植于中國北方地區，大多數品種的果實于5～8月成熟[1]。杏果實呼吸強度較高，因而不耐貯藏，采后容易發生軟化腐爛、失水、褐變等品質劣變，因此貨架期較短。這些因素限制了杏果實的市場供給時間[2]。

近冰點溫度（near freezing-point temperature，NFT）貯藏是將果實在接近生物自然結冰點溫度下進行長期保存的一項新型貯藏技術[3]。果蔬含有大量的可溶性糖、可溶性酸及可溶性果膠等溶質分子，果肉組織、細胞的結冰點溫度顯著低于0 ℃。近年來針對鮮切西藍花[4]、油桃[5]、藍莓[6]、甜櫻桃[7]、磨盤柿[8]等多種果蔬的研究表明，在低于0 ℃、略高于果肉冰點的溫度下貯藏果蔬，比以往廣泛應用的0 ℃或是高于0 ℃貯藏的保鮮作用效果更佳。相較于傳統冰溫貯藏，NFT貯藏能更精確地使果蔬在不發生凍害的前提下，保證果蔬更接近結冰點溫度貯藏。

盡管很多研究將氣調、0 ℃冷藏和保鮮劑處理結合應用，仍很難將杏果實進行長期（大于45 d）貯藏并保持良好的商品品質[1,9]。長時間低溫貯藏會使某些品種的果蔬發生冷害，例如褐變、果肉纖維化、產生異味、不能正常后熟等問題[10]。有研究發現，某些品種杏果實在4 ℃下貯藏35 d會出現蔗糖、果糖、葡萄糖、山梨糖醇含量迅速下降等品質劣變問題，并且果肉過氧化氫（H2O2）和丙二醛（malonaldehyde，MDA）的蓄積也隨之增加[11]。NFT貯藏可以顯著地提高櫻桃貯藏后的品質，并高效保持抗氧化功能[7]。

本研究利用新研制的精準控溫貯藏設備，系統地研究其對蜜杏貯后品質的影響，并從活性氧代謝、乙烯代謝方面探究了NFT貯藏的影響作用機制，以期為實際生產中應用NFT貯藏鮮技術提供指導依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供實驗的蜜杏果實采購自北京新發地果蔬批發市場，選取成熟度一致的低熟果實放入塑料筐內，立即運回保鮮實驗室進行后續處理。挑選無病蟲害，無機械損傷，大小、顏色、外觀一致的杏果實進行處理。參照本課題組前期建立的研究方法[1]，選取20 個蜜杏果實進行結冰點和過冷點的測定，確定蜜杏果實的結冰點為 （－2.3f 0.1）℃，過冷點為（－2.5f 0.2）℃；因此本實驗中的NFT確定為（－2.2f 0.2）℃。

甲醇、乙酸（色譜級） 賽默飛世爾科技有限公司； 氫氧化鈉、碳酸鈣、丙酮、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、二硫蘇糖醇（分析純） 北京化工廠；H2O2測試盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

阿貝折光儀 上海精密科學儀器有限公司；SC-10精密色差儀 蘇州欣美和儀器有限公司；GY-2硬度計 浙江拓普儀器有限公司；GC-7890F氣相色譜儀 上海天美生物儀器有限公司；TU-1810APC紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；LC-20AT泵、SPD-M20A二極管陣列檢測器和C18反相柱組成的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司。

NFT貯藏采用本實驗室近期發明研制的設備[3]進行，這是一種溫控精度高、貯藏室溫度均一、具備超溫預警機制、可靠性高的用于果蔬近冰溫冷藏的專用冷藏設備。其通過以下技術方案實現的：該果蔬NFT貯藏專用冷藏柜具有兩套控溫措施，通過制冷板和流風機共同調節溫度變化，既可以保證貯藏室的溫度波動小，又可以減少制冷機的開機頻率，保護壓縮機。該設計所產生的循環送風模式使貯藏室內部形成了小風力循環氣流，保證貯藏室內溫度的均一性。報警設備可以進行低溫報警，并自動采取緊急措施回避果蔬凍害，可以通過SIM電話呼叫功能通知管理員進行處理。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及條件

實驗進行2 批次，每批次3 0.0 k g 杏果實（每5.0 kg杏果實分裝在一個塑料筐中，每筐果實分別使用自發氣調袋套袋），分別在（0f 2）℃和NFT （（－2.2f 0.2）℃）下貯藏70 d。貯藏期間每2 周（14 d）取樣一次進行指標測定。兩個溫度的杏果實貯藏70 d后均置于常溫（（22.0f 1.0）℃）進行貨架觀察。0 ℃樣品只進行4 d貨架觀測，NFT樣品可以進行6 d貨架觀測，間隔2 d取樣一次。

1.3.2 乙烯釋放速率和呼吸速率的測定

乙烯和呼吸速率的測定參考文獻[12]，NFT貯藏和0 ℃貯藏過程中，將6 個杏果實放在常溫下（20 ℃）回溫1.5 h后放入2 L的密閉容器中2 h，收集1 mL的頂空氣體，利用GC-7890F氣相色譜儀測定乙烯和CO2濃度。乙烯的釋放速率用外標法進行測定，單位為μL/（kgg h）。呼吸速率以每千克杏每小時所累積釋放的CO2質量計，單位為mg/（kgg h）。

1.3.3 乙烯代謝相關酶和1-氨基環丙烷-1-羧酸含量的測定

1-氨基環丙烷-1-羧酸合成酶（aminocyclopropane carboxylate synthetase，ACS）和1-氨基環丙烷-1-羧酸氧化酶（aminocyclopropane carboxylate oxidase，ACO）酶液提取和活力測定參考Yu Mengmeng等[13]的方法。以所測溶液中乙烯的產生速率表示鮮杏果實ACS的活力，即為nmol/（hg g）；以所測溶液中乙烯的產生速率表示鮮杏果實ACO的活力，即為nmol/（hg g）。1-氨基環丙烷-1-羧酸（1-amino-1-cyclopropanecarboxylic acid，ACC）含量的測定參照文獻[14]，單位為mmol/g，結果以鮮質量計。

1.3.4 糖酸比、色澤、可溶性固形物質量分數和硬度的測定

杏的色澤測定采用SC-10精密色差儀；可溶性固形物質量分數采用阿貝折光儀測定；硬度測定采用 GY-2硬度計。杏果實可滴定酸質量分數的測定采用酸堿中和法[15]。采用HPLC法對可溶性糖組分測定，具體參照文獻[11]的方法進行。總糖含量為各單糖含量之和，杏果實的糖酸比按下式[16]計算。

1.3.5 細胞膜透性和丙二醛、H2O2含量的測定

采用電導儀測定電導率，通過電導率表征細胞膜透性。MDA含量的測定參照本課題組前期建立的方法[17]進行。H2O2含量使用H2O2測試盒測定。

1.3.6 抗氧化能力和抗壞血酸、總酚、酚類物質含量的測定

杏果實的總酚提取采用乙醇提取法[18]。提取溶液用于1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、鐵離子清除抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）、總酚含量的測定和酚類物質的分析。

抗壞血酸的含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[18]測定。總酚含量的測定使用福林-酚試劑法[19]。抗氧化能力主要測定DPPH自由基清除能力和FRAP，其測定參考Zhao Handong等[5]的方法，這兩種抗氧化活力以奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox）為標準當量，單位g/kg。采用HPLC法對杏的酚類物質含量進行測定，并根據標準品繪制標準曲線進行定量[1]。

1.3.7 活性氧代謝相關的酶活力的測定

過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活力的測定參考曹建康等[18]的方法。以每克鮮質量杏果實樣品的反應體系在470 nm波長處每分鐘吸光度增加1為1 個POD活力單位（U）；以每克鮮質量杏果實樣品的反應體系在240 nm波長處每分鐘吸光度增加0.01為1 個CAT活力單位（U）。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的測定參照文獻[20]，以每分鐘每克鮮質量杏果實樣品的反應體系在560 nm波長處對氮藍四唑光化還原的抑制率為50%時為1 個SOD活力單位（U）表示；以每克鮮質量杏果實樣品反應體系每分鐘OD290nm變化0.01為1 個APX活力單位（U）。

1.4 數據統計與分析

所有實驗都設置3 次平行實驗，利用Excel軟件對數據進行整理和制圖，采用SPSS 18.0軟件對測定的數據進行方差分析，利用鄧肯氏多重比較對差異顯著性進行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 NFT貯藏對蜜杏呼吸強度和后熟品質變化的影響

圖 1 NFT貯藏對蜜杏果實呼吸強度（A）、可溶性固形物 質量分數（B）、硬度（C）和糖酸比（D）的影響Fig. 1 Effect of storage at NFT on repiration rate (A), soluble solids content (B), firmness (C), and sugar/acid ratio (D) of apricots

在呼吸躍變型果實的后熟過程中，時常伴隨著果實的軟化、呼吸高峰的出現[1,10,15]及果實色澤的轉變[10,19]等現象。其中糖酸比的變化在一定程度上反映了果實的成熟指數[1]。由圖1A可知，NFT貯藏延遲了杏果實呼吸高峰的出現，0 ℃貯藏的杏果實呼吸高峰出現在第42天，而NFT貯藏的杏果實呼吸強度在貯藏第56天才達到高峰。貯藏后的杏果實在貨架存放時均會出現呼吸強度上升的現象，NFT貯藏貨架后4 d的杏果實呼吸強度顯著高于0 ℃貯藏貨架4 d的杏果實。

由圖1B可知，隨著貯藏時間延長，杏果實的可溶性固形物質量分數呈先升高后下降的趨勢。NFT貯藏末期和貨架后的杏果實可溶性固形物質量分數明顯高于0 ℃貯藏的杏果實。

由圖1C可知，經過70 d的貯藏和6 d的貨架后，杏果實硬度都出現明顯的下降，但貯藏70 d后，NFT貯藏的果實硬度高于低于0 ℃貯藏的杏果實；在貯后貨架存放時，0 ℃貯藏的杏果實硬度沒有顯著變化（P＞0.05），而NFT貯藏的杏果實硬度從8.61 N下降至4.29 N。這說明長期0 ℃貯藏的蜜杏果實后熟軟化出現異常，而NFT貯藏的樣品則可以正常軟化。

由圖1D可知，經過70 d貯藏后，果肉糖酸比均增加，NFT和0 ℃貯藏蜜杏的糖酸比分別達到9.08和9.51。與貯藏70 d相比，經過貨架存放后NFT貯藏的杏果實糖酸比顯著上升，而0 ℃樣貯藏的杏糖酸比無顯著變化，這與硬度變化結果相似。表明NFT貯藏對于杏果實貯后和貨架食用品質有良好保持作用。

2.2 NFT貯藏對蜜杏外觀的影響

圖 2 NFT貯藏對蜜杏果皮色澤L*（A）、a*（B）、b*（C）值的影響及杏果實貯后照片（D）Fig. 2 Impact of storage at NFT on L* (A), a* (B), b* (C) values of apricot peel and pictures of apricots during storage (D)

果實表皮色澤變化能反映出蜜杏果實的貯后品質變化。從圖2A～C可以看出，NFT貯藏果實色澤變化程度明顯小于0 ℃貯藏的果實。而貨架存放后，NFT貯藏的杏果實轉紅非常明顯，a*值從11.67上升至28.29，顯著增加了142.4%。從圖2D中可以看出，NFT貯藏后果實外觀正常，果皮和果肉都轉為橙紅色；而0 ℃貯藏的杏果實表皮和果肉呈現黃色，果肉有褐變、果皮凹陷，表明發生一定程度的冷害。綜合上述杏果實貯后品質的結果可以發現，NFT貯藏比0 ℃貯藏能更好地保持杏果實貯藏后品質保持作用，且能延長杏果實貯藏后的貨架期，并使杏果實正常完成后熟。

2.3 NFT貯藏對蜜杏果實乙烯代謝的影響

杏是一種典型的呼吸躍變型果實[21]，而乙烯是呼吸躍變型果實成熟的一種必要內源生物激素[22]。由 圖3A可知，蜜杏果實在貯藏過程中乙烯釋放速率很低，最高峰值也只有0.29 μL/（kgg h）；但在貯藏后的貨架存放期間，NFT貯藏的杏乙烯釋放量峰值達到了 3.97 μL/（kg h），是0 ℃貯藏杏果貨架期間乙烯釋放峰值的2.7 倍，這可能與杏貯藏后熟品質變化有直接關系。蜜杏在0 ℃貯藏70 d后后熟出現異常，可能是其內源乙烯合成能力下降造成的。在香蕉[23]、李[24]、番木瓜[25]果實的研究中也有相似的結論，由于低溫脅迫造成乙烯代謝紊亂，從而出現后熟異常等冷害問題。

圖 3 NFT貯藏對杏果實乙烯釋放量（A）、ACC含量（B）、 ACS活力（C）和ACO活力（D）的影響Fig. 3 Effect of storage at NFT on apricot ethylene production (A), ACC content (B), ACS activity (C), and ACO activity (D)

ACC是果實乙烯合成前體物質，ACS是合成ACC的關鍵酶，ACO是催化ACC生成乙烯的關鍵酶。由 圖3B～D可知，貯藏過程中杏果實ACC含量和ACS、ACO活力均處于很低的水平；貯藏后的貨架觀測期間，NFT杏果實的ACC含量、ACS和ACO活力均明顯上升，但0 ℃貯藏果實貨架期間的ACC含量、ACS和ACO活力變化沒有NFT貯藏果實貨架期果實明顯，這與乙烯釋放情況一致。類似結果在番茄[22]和鱷梨[26]、粉蕉[27]果實乙烯代謝的研究中也有報道。

由上述研究結果可以推斷，0 ℃低溫長時間貯藏破壞了蜜杏果實ACS的合成能力，影響了杏果實后熟過程中ACC的合成，同時也抑制了ACO活力提高，因而導致0 ℃貯藏杏果實貯后乙烯合成比NFT貯藏的杏果實更少，進而導致0 ℃貯后杏果實后熟情況比NFT果實更差。

2.4 NFT貯藏對貯后蜜杏活性氧指標變化的影響

NFT貯藏杏果實在貯后貨架期表現出比0 ℃更好的乙烯代謝和后熟品質很可能是因為在貯藏過程中的活性氧代謝體系更穩定，而活性氧代謝是維護果蔬體內正常代謝的基礎[7,19,28]。細胞膜透性增強是組織細胞衰老變化的一個標志性變化，H2O2是植物體內細胞活性氧代謝作用的副產物，具有強氧化性，能夠導致生物大分子的氧化損傷和膜的氧化損傷。由圖4A可知，杏果實果肉細胞膜透性隨著貯藏時間延長而不斷上升，特別是在貯藏后的貨架期間，0 ℃貯藏的杏果實組織膜透性急劇增大，明顯高于NFT貯藏的杏果實組織。由圖4B、C可知，NFT和0 ℃貯藏杏果實肉中MDA和H2O2含量在貯藏期間均呈現緩慢上升趨勢，但在貯藏末期，0 ℃貯藏杏果實肉中的H2O2水平明顯高于NFT貯藏的杏果實；而貨架觀測期間，0 ℃貯藏杏果實肉MDA和H2O2含量急速上升，0 ℃貨架第4天MDA和H2O2含量分別是NFT貨架第6天杏樣品的1.3 倍和1.6 倍。這說明NFT貯藏可以更有效地抑制活性氧代謝中MDA和H2O2的積累，減少細胞膜被破壞程度。

圖 4 NFT貯藏對杏果實細胞膜透性（A）、MDA含量（B）和 H2O2含量（C）的影響Fig. 4 Effect of storage at NFT on apricot membrane permeability (A), MDA content (B) and H2O2 content (C)

2.5 NFT貯藏對貯后蜜杏抗氧化活性的影響

由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，蜜杏果實的DPPH自由基清除能力和FRAP不斷下降。貯藏70 d后，NFT貯藏杏果實的DPPH自由基清除能力和FRAP分別下降了10.4%和11.1%；在0 ℃的杏果實DPPH自由基清除能力和FRAP分別下降了31.3%和15.9%。在貨架存放期間，杏果實抗氧化能力進一步下降，最終NFT組杏果實貯后6 d貨架的抗氧化能力明顯高于0 ℃貯后4 d貨架的杏果實 （P＜0.05）。本研究中的結果與NFT貯藏通過提高抗氧化能力來保護櫻桃活性氧代謝穩定的研究結果[7]一致。

圖 5 NFT貯藏對杏果實DPPH自由基清除能力（A）和FRAP（B）的影響Fig. 5 Effect of storage at NFT on apricot antioxidant capacity in terms of DPPH radical scavenging capacity (A) and FRAP (B)

2.6 NFT對貯后蜜杏抗壞血酸和酚類物質含量的影響

圖 6 NFT貯藏和0 ℃貯藏對杏果實總酚（A）、抗壞血酸（B）、 綠原酸（C）和蘆丁（D）含量的影響Fig. 6 Impact of storage at NFT versus 0 ℃ on TPs (A), ascorbic acid (B), chlorogenic acid (C) and rutin contents (D) in apricots

杏果實的抗氧化能力主要源于多酚物質和抗壞血酸的作用，蘆丁和綠原酸是杏果實多酚的主要成分[1]。如圖6所示，杏果實中總酚、抗壞血酸、蘆丁和綠原酸含量隨貯藏時間延長呈現不斷下降趨勢。相對于0 ℃貯藏，NFT貯藏明顯抑制了杏果實總酚、抗壞血酸、蘆丁和綠原酸含量下降。貨架期間，NFT貯藏組杏果實的4 種抗氧化活性物質成分含量顯著高于0 ℃貯藏的杏果實 （P＜0.05）。表明NFT貯藏可以有效地保留抗氧化活性物質，保持果實在貯藏過程中的抗氧化能力。

2.7 NFT貯藏對貯后蜜杏活性氧代謝酶活力的影響

在果蔬生物活性氧清除系統中，SOD是歧化超氧陰離子形成H2O2的關鍵酶，POD、CAT、APX是清除過量H2O2的相關酶，因此保持這一系列酶活性對于保護果蔬活性氧代謝和長時間貯藏有重要的意義[29]。如圖7A、B所示，貯藏過程中，蜜杏的SOD和CAT活力呈現先增加后下降的趨勢；在貯藏70 d后，NFT貯藏杏果實SOD和CAT活力顯著高于0 ℃貯藏的杏果實。貯藏后貨架存放期間，NFT杏樣品的SOD活力急劇增加。NFT和0 ℃貯藏的杏果實CAT活力在貨架期都出現一個高峰，但NFT貯藏杏果實的CAT活力峰值比0 ℃貯藏杏果實CAT活力峰值高21.3%。蜜杏的APX活力在貯藏過程中持續下降，但在貯藏后期NFT貯藏杏果實的APX活力顯著高于0 ℃貯藏杏果實（圖7C）。在貯藏過程和貯后貨架中，NFT樣品和0 ℃樣品的POD活力差異不明顯（圖7D），這說明在蜜杏中POD活力可能和活性氧清除能力的關系不大。而SOD、CAT和APX是蜜杏在長時間低溫貯藏中清除活性氧的關鍵酶，并且在長時間低溫貯藏后，0 ℃貯藏的蜜杏上述酶活力開始降低，從而導致MDA和H2O2的積累，并最終對杏果實的其他代謝造成不可逆的影響。

圖 7 NFT貯藏對杏果實SOD（A）、CAT（B）、APX（C）和 POD（D）活力的影響Fig. 7 Effect of storage at NFT on SOD (A), CAT (B), APX (C) and POD (D) activities of apricots

3 討 論

在本實驗中，蜜杏果實在經過長時間低溫貯藏后，產生了H2O2等大量活性氧物質。這是由于植物在面對不同的環境脅迫時，會迅速產生大量的活性氧（包括羥自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫等）來進行自我防御[28]。當產生過量的活性氧時，植物自身抗氧化系統有效地發揮作用，包括非酶體系抗氧化物質（多酚、抗壞血酸等）及酶系統的抗氧化酶（SOD、CAT、APX、POD、谷胱甘肽還原酶等）[29]。由于NFT貯藏可以有效地保持杏果實在貯藏70 d后SOD、CAT和APX活力和抗壞血酸、多酚等生物活性物質含量，因此可以維持貨架后杏果實的活性氧代謝的穩定性，從而保證杏果實貨架過程中的品質。而0 ℃貯藏由于活性氧代謝系統失衡（酶活力、抗氧化活性物質含量和抗氧化能力降低），與NFT貯藏組相比，則出現貨架后乙烯合成前體和乙烯釋放量降低、ACS和ACO活力下降的現象，從而使0 ℃貯藏的蜜杏果實出現不能達到正常成熟的品質狀態的現象。這可能是因為，在正常狀態下，植物活性氧的產生與清除處于動態平衡的狀態，活性氧濃度很低時不會對機體造成傷害，但是如果果蔬在遭遇逆境脅迫，機體內的氧代謝失調導致活性氧累積，而細胞內活性氧清除系統不能及時有效地清除過量的活性氧，較高濃度的活性氧會對植物體的其他正常生理代謝造成嚴重的傷害[19,29]。

4 結 論

本研究結果表明，0 ℃下冷藏的蜜杏在常溫貨架過程中會出現不能正常成熟軟化等貯后生理紊亂現象，而NFT貯藏的杏果實在常溫貨架放置后能夠達到正常成熟的品質狀態。貯藏和貨架過程中，NFT貯藏后的杏果實乙烯釋放量、ACC含量和ACS、ACO活力均高于0 ℃貯藏后的杏果實樣品。在經過70 d的貯藏后，NFT能夠比0 ℃貯藏更好地維持杏果實SOD、APX、CAT活力。并且與0 ℃貯藏杏果實相比，NFT貯藏組杏果實的抗壞血酸含量、總酚含量和DPPH自由基清除能力更高，MDA和H2O2的積累更少。因此，NFT貯藏不僅可以有效延長杏果實的貯藏期，還可以維持蜜杏正常的生理代謝進程，保持杏果實在冷藏后仍具有較好的貨架品質。NFT貯藏技術作為一種安全簡便、效果明顯的保鮮技術，可以更廣泛地推廣至其他具有冷耐受性的果蔬產品。