低聚葡萄籽原花青素對順鉑所致人胚腎細胞 線粒體損傷的保護作用

韓何丹，杜月梅，王 海，趙艷萌，高麗萍

（北京聯合大學生物化學工程學院，生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100023）

順鉑（cis-diamminedichloroplatinum，CDDP）是臨床上廣泛應用的一種抗癌藥物，在目前臨床應用的聯合化療方案中，以CDDP為主藥或有CDDP參與配伍的占70%～80%，并且CDDP在多種惡性腫瘤的治療中都取得了顯著療效[1-2]。但CDDP在治療過程中會對人體造成許多毒副作用，其中腎毒性最為嚴重[3-5]。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin，GSP）是具有多種活性功能的一類多酚化合物的總稱，具有保護心血管、免疫、抗炎、抗菌、抗過敏、抗腫瘤、抗病毒活性等生理功能[6-8]。由于結構中含有大量的酚羥基，GSP具有很強的抗氧化活性[9-10]。其中生物活性最強的是低聚GSP（oligomeric-GSP，O-GSP）[11]。GSP對肺癌、卵巢癌、皮膚癌、前列腺癌、結腸癌等均有不同程度的抑制作用，可以誘導癌細胞凋亡[12]；O-GSP可增強CDDP對人肺癌細胞A549的殺傷作用[13]。此外，O-GSP還具有強大的清除自由基、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等作用[14-15]。

研究表明，氧化應激是CDDP誘發腎毒性的主要原因，而線粒體功能障礙是CDDP誘發腎毒性的中心 環節[16-18]。前期研究表明，O-GSP對CDDP誘發的腎毒性具有拮抗作用，但其作用機制尚不明確[19]。此外，O-GSP對CDDP引起的腎臟細胞線粒體損傷是否具有保護作用及其作用機制還鮮見報道。因此，本研究用CDDP建造人胚腎細胞HEK293毒性模型，通過檢測細胞內抗氧化指標、線粒體功能指標及細胞凋亡率，探究O-GSP對CDDP所致HEK293細胞線粒體損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HEK293細胞 北京協和醫學院基礎學院細胞中心。

CDDP注射用凍干型粉劑（使用時用無菌生理鹽水配制） 山東齊魯制藥廠；O-GSP（色譜級，原花青素純度≥99%，其中含二聚體56%（質量分數，后同）、三聚體12%、四聚體6.6%、單體和其他大分子寡聚體20.4%，使用時用蒸餾水現用現配） 天津尖峰天然產物研究開發有限公司；胎牛血清 美國Gibico公司；DMEM 培養液 美國Introvigen公司；雙抗 美國Sigma公司；胰酶 美國Genview公司。

還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、己糖激酶（hexokinase，HK）、 蘋果酸脫氫酶（malic dehydrogenase，MDH）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒、活性氧（reaction oxygen species，ROS）檢測試劑盒、ATP檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒 碧云天生物技術研究所；細胞凋亡試劑盒 美國Genview公司。

1.2 儀器與設備

5840R型低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；WFZUV-4802H型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；BS110S型電子天平 美國Sartorius公司；多功能酶標儀 美國Thermo公司；流式細胞儀 美國BD FASCailbur公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

HEK293細胞常規培養于含有質量分數15%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養基中，培養箱環境為37 ℃、5% CO2，飽和濕度。每隔1 d換一次培養基，待細胞融合至80%～90%時用胰酶消化，1∶2進行傳代，每3～4 d傳代1 次。選用對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.3.2 細胞分組及處理

參考前期研究，細胞分為4 個實驗組：對照組，未加入CDDP和O-GSP；CDDP組，加入20 mg/L CDDP；O-GSP組，加入16 mg/L O-GSP；CDDP＋O-GSP組，加入20 mg/L CDDP前4 h加入16 mg/L O-GSP[19]。繼續培養24 h。

1.3.3 HEK293細胞蛋白含量及MDA和還原型GSH含量測定

細胞經1.3.2節方法處理后，消化并收集細胞，后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗兩遍，離心棄上清液，再用PBS重懸。將裝有細胞懸液的離心管置于冰水浴中，超聲破碎：功率300 W，3～5 s/次， 間隔3 0 s，重復3 ～5 次；取破碎好的勻漿液， 12 000 r/min離心10 min，收集上清液按照試劑盒說明書進行操作，測定細胞蛋白含量及MDA、還原型GSH含量。

1.3.4 細胞內ROS相對含量的檢測

將HEK293細胞按1h 105個/mL接種至6 孔板，并于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h。經1.3.2節方法處理后，去除培養液，加入1 mL含有10 mol/L 2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽的新鮮培養基，在37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，用無血清細胞培養液洗滌細胞3 次，再用胰酶消化制成單細胞懸液，在1 000 r/min下離心5 min收集細胞。細胞用PBS重懸后，經200 目網過濾去除雜質，收集于流式細胞儀專用管內，上機檢測，結果顯示為流式直方圖。

1.3.5 細胞內HK、LDH和MDH活力的檢測

按照1.3.3節方法處理細胞，將細胞破碎并收集上清液，按照試劑盒說明書操作，檢測細胞內HK、LDH和MDH活力。

1.3.6 細胞內ATP含量的檢測

先將細胞按照1.3.4節方法正常培養24 h，經不同藥物處理后，吸除培養液，每孔加入50 μL裂解液進行裂解，之后4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，按照試劑盒說明測定細胞內ATP含量。

1.3.7 細胞內線粒體膜電位的檢測

先將細胞按照1.3.4節方法正常培養24 h，經不同藥物處理后，用胰酶消化各孔細胞，制成單細胞懸液，細胞懸液在1 000 r/min下離心5 min收集細胞，重復1 次。將細胞重懸于0.5 mL細胞培養液中，加入0.5 mL JC-1（新型陽離子羰花青染料）染色工作液，顛倒數次混勻。細胞培養箱中37 ℃孵育20 min。1 000 r/min、4 ℃離心5 min，沉淀細胞，棄上清液。用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2 次，再用500 μL JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，200 目網過濾去除雜質，收集于流式細胞儀專用管內，上機檢測。染色后收集細胞，采用紅色的FL-2通道，結果以第一象限與第四象限熒光強度的比值反映受損細胞線粒體膜電位的下降情況。

1.3.8 細胞凋亡率的檢測

先將細胞按照1.3.4節方法正常培養24 h，經不同藥物處理后，吸除培養基，用胰酶消化并制成細胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液。1 mL PBS洗滌細胞兩次，然后將細胞重懸于200 mL Binding Buffer中，加入10 mL Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）輕輕混勻，避光室溫反應15 min，再加入300 μL Binding Buffer以及5 μL溴化丙錠（propidium iodide，PI），在1 h內上機檢測。

1.4 數據統計與分析

應用SPSS 22.0軟件進行統計分析，實驗結果重復3 次，數據均以平均值±標準差表示。組間差異采用單因素方差分析處理。P＜0.01判斷為具有極顯著性差異。采用Origin 9.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞氧化損傷的影響

2.1.1 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞中MDA、還原型GSH含量變化的影響

圖 1 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞抗氧化能力變化的影響Fig. 1 Effect of O-GSP on CDDP-induced changes in antioxidant capacity in HEK293 cells

如圖1所示，CDDP作用于HEK293細胞24 h，會使MDA含量較對照組極顯著升高（P＜0.01），還原型GSH含量較對照組極顯著降低（P＜0.01）。經O-GSP提前4 h孵育后再用CDDP作用24 h，該組的MDA含量較CDDP組極顯著降低（P＜0.01），而還原型GSH含量較CDDP組極顯著升高（P＜0.01）。與對照組相比，O-GSP單獨作用于細胞，MDA含量和還原型GSH含量均無明顯變化。表明O-GSP對CDDP所致的HEK293細胞氧化損傷有一定的保護作用。

2.1.2 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞中ROS相對含量變化的影響

圖 2 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞ROS相對含量變化的影響Fig. 2 Effect of O-GSP on CDDP-induced changes in ROS relative content in HEK293 cells

表 1 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞ROS相對含量變化的影響Table 1 Effect of O-GSP on CDDP-induced changes in ROS relative content in HEK293 cells

如圖2及表1所示，CDDP能夠導致細胞ROS相對含量較對照組極顯著升高（P＜0.01），而經O-GSP預處理的CDDP＋O-GSP組ROS相對含量較CDDP組極顯著降低（P＜0.01）。與對照組比較，O-GSP單獨作用細胞內ROS相對含量無明顯變化。提示CDDP會引起細胞ROS生成量增加，而O-GSP預處理對這種變化有緩解作用。

2.2 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞線粒體功能損傷的影響

2.2.1 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞糖代謝酶活力的影響

圖 3 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞糖代謝酶活力變化的影響Fig. 3 Effect of O-GSP on CDDP-induced changes in glycometabolismrelated enzyme activities in HEK293 cells

如圖3所示，CDDP單獨作用于細胞24 h后，誘發HK活力和LDH相對活力較對照組極顯著提升（P＜0.01）。而與CDDP組相比，經O-GSP預處理的CDDP＋O-GSP組HK活力和LDH相對活力均極顯著降低（P＜0.01）。與對照組相比，O-GSP單獨作用使細胞HK活力和LDH相對活力均無明顯變化。MDH活力的變化與HK和LDH恰好相反。CDDP使MDH活力較對照組極顯著降低，而經O-GSP預處理的CDDP＋O-GSP組MDH活力較CDDP組極顯著升高（P＜0.01）。與對照組相比，單獨O-GSP給藥使MDH活力無明顯變化。表明O-GSP對CDDP誘導細胞內糖代謝酶活力的變化有明顯的保護作用。

2.2.2 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞中ATP相對含量變化的影響

表 2 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞ATP相對含量變化的影響Table 2 Effect of O-GSP on CDDP-induced changes in ATP relative content in HEK293 cells

如表2所示，CDDP單獨作用使細胞內ATP相對含量較對照組極顯著降低（P＜0.01）。與對照組相比，O-GSP單獨作用使細胞內ATP相對含量無明顯變化。而經O-GSP預處理4 h后再加CDDP，細胞內ATP相對含量較CDDP組極顯著升高（P＜0.01）。表明CDDP能夠引起細胞產能減少，而O-GSP預處理在一定程度上對細胞產能減少的狀況有所改善。

2.2.3 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞線粒體膜電位變化的影響

圖 4 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞線粒體膜電位變化的影響Fig. 4 Effect of O-GSP on CDDP-induced changes in mitochondrial transmembrane potential in HEK293 cells

表 3 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞線粒體膜電位變化的影響Table 3 Effect of O-GSP on CDDP-induced changes in mitochondrial transmembrane potential in HEK293 cells

由圖4及表3可見，與對照組相比，CDDP組線粒體膜電位極顯著降低（P＜0.01），經過O-GSP預處理的CDDP＋O-GSP組線粒體膜電位較CDDP組極顯著升高（P＜0.01）。而O-GSP單獨作用使細胞中線粒體膜電位較對照組無明顯變化。

2.3 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞凋亡的影響

圖 5 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞凋亡的影響Fig. 5 Effect of O-GSP on CDDP-induced apoptosis in HEK293 cells

表 4 O-GSP對CDDP所致HEK293細胞凋亡的影響Table 4 Effect of O-GSP on CDDP-induced apoptosis in HEK293 cells

由圖5及表4可見，與對照組相比，CDDP作用于細胞使細胞早期凋亡率和晚期凋亡率極顯著升高（P＜0.01）。O-GSP預處理使細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率較CDDP組相比均極顯著降低（P＜0.01）。O-GSP單獨作用對細胞的凋亡率未造成明顯變化。表明O-GSP可能參與CDDP誘導的細胞凋亡途徑并起到一定的保護作用。

3 討 論

前期研究結果表明，CDDP對HEK293細胞生長有明顯的抑制作用，隨著CDDP濃度不斷增大，對細胞生長的抑制率越來越明顯[20]。原花青素作為一種有效的抗氧化劑對細胞損傷具有一定的保護作用，其中主要涉及對DNA損傷和氧化損傷的保護。有研究表明，GSP提取物治療可通過降低氧化應激有效預防母雞卵巢衰老 過程[21]。Uluso等[22]通過比較N-乙酰半胱氨酸和GSP對小鼠感應腎病的保護作用，發現GSP對小鼠腎細胞具有更好的保護作用。Gao Zhaoli等[23]研究結果表明，GSP提取物可通過Caspase-12通路在鏈脲霉素誘導的糖尿病性腎病中保護腎功能，減輕內質網應激誘導的細胞凋亡。

CDDP通過增加ROS的產生和抑制ROS的還原清除，增加細胞內ROS含量，引發氧化應激過程，最終造成腎臟細胞損傷。線粒體功能障礙是CDDP誘發腎毒性的中心環節，氧化應激與線粒體功能障礙之間互相影響[24-25]。 各種來源的自由基可攻擊生物膜引發脂質過氧化作用，脂質過氧化的許多代謝產物對機體具有毒性作用，其中MDA的毒性最顯著，它是生物膜中的多不飽和脂肪酸在受到自由基攻擊后發生脂質過氧化的最終分解產物[26-27]。 MDA含量的異常增高會引起線粒體和細胞損傷，故機體或細胞中MDA含量可反映細胞抗氧化水平和脂質過氧化水平。本研究結果顯示，CDDP可以誘發HEK293細胞中GSH含量極顯著降低，同時使MDA含量極顯著升高。說明GSH被CDDP消耗，降低了機體清除自由基的能力，從而發生氧化應激反應，這與先前其他相關研究的結果[28-29]一致。有研究表明，GSP具有較強的抗氧化能力，并且通過清除自由基對牙周病致病菌脂多糖誘發的 巨噬細胞氧化應激有顯著的保護作用[6]。本研究中提前4 h對HEK293細胞采用O-GSP預處理并檢測抗氧化指標，結果表明，O-GSP預處理組較CDDP組細胞中還原型GSH含量極顯著升高，同時MDA含量極顯著降低。說明O-GSP減輕了還原型GSH的損耗，并在一定程度上抑制了脂質過氧化，對CDDP誘發的氧化應激具有緩解作用。

CDDP進入細胞后，可以直接攻擊線粒體裸露的DNA使其受損，造成線粒體功能障礙。其中引起的一系列氧化應激反應不僅能夠抑制線粒體呼吸作用，減緩呼吸鏈的電子傳遞，增加ROS的產生，還會導致解偶聯蛋白的表達上調，引起質子泄漏的發生，使得線粒體膜電位下降，最終降低ATP生成量[30]。MDH是三羧酸循環的標志酶，而HK和LDH是糖酵解過程的標志酶。線粒體通過三羧酸循環進行有氧呼吸的產能過程受到抑制，細胞所需能量匱乏，而糖酵解作用增強僅可提供少量能量。本研究對細胞糖代謝中酶活力的檢測結果顯示，CDDP作用于HEK293細胞24 h后，相較對照組，細胞內同時出現MDH活力極顯著降低與HK活力、LDH相對活力極顯著升高，這與先前相關研究結果[31]一致。ATP含量和線粒體膜電位的檢測結果顯示，CDDP導致HEK293細胞內ATP相對含量和線粒體膜電位均極顯著降低，表明線粒體呼吸電子傳遞鏈受到抑制，使細胞內ATP相對含量減少，不能滿足細胞正常生理活動需要。同時，上述過程引起的線粒體內膜泵送質子紊亂，導致線粒體跨膜電位降低，又進一步減少了ATP的生成。本研究結果表明，與CDDP組相比，經O-GSP預處理的細胞ROS相對含量極顯著降低，MDH活力極顯著升高，而HK活力、LDH相對活力極顯著降低，此外，細胞內ATP相對含量和線粒體膜電位均顯著升高。提示O-GSP對CDDP誘發的HEK293細胞糖代謝異常、ATP匱乏和線粒體膜電位降低均有一定的保護作用，該作用可能與O-GSP強抗氧化性有關，O-GSP有效地清除了細胞內的ROS，緩解了細胞內的氧化應激，減輕了細胞和線粒體的氧化損傷，從而對線粒體起到了保護作用。

研究顯示，誘導腎小管上皮細胞凋亡是CDDP腎損傷的重要機制之一。其中，線粒體凋亡途徑是CDDP誘導腎小管上皮細胞凋亡的主要途徑[32]。前期研究結果顯示，CDDP能夠導致HEK293細胞凋亡率較對照組極顯著升高。結合前一部分研究結果分析，內源性的線粒體通路參與了CDDP引起的HEK293細胞凋亡。Du Yu等[33]通過對心肌細胞H9C2細胞凋亡研究發現，O-GSP對心肌細胞H9C2凋亡具有一定的保護作用，該保護作用是通過誘導細胞內源性抗氧化酶活力實現的。此外，還有研究發現，O-GSP通過其抗氧化作用對H2O2誘導的成骨細胞MC3T3-E1細胞凋亡具有潛在的保護作用[34]。本研究中，與CDDP組相比，O-GSP預處理后HEK293細胞早期凋亡率和中晚期凋亡率均極顯著降低。提示O-GSP對CDDP誘發的細胞凋亡具有潛在的保護作用，而這一作用可能是由于O-GSP能夠緩解線粒體損傷，從而抑制了HEK293細胞由線粒體途徑介導的細胞凋亡。

4 結 論

O-GSP預處理能夠提高HEK293細胞的抗氧化能力，減輕CDDP造成的氧化損傷，并且能通過改善CDDP誘發的糖代謝異常及ATP相對含量和線粒體膜電位的降低，從而減輕CDDP誘發的細胞線粒體損傷。此外，O-GSP對CDDP誘發的細胞凋亡具有一定的抑制作用，該作用可能與抑制細胞凋亡的線粒體途徑有關。說明O-GSP對CDDP誘發的HEK293細胞毒性具有明顯的保護作用，且該作用與O-GSP保護CDDP所致線粒體損傷有關。O-GSP具有抗氧化等多種生理功能，是一種很有價值的天然產物，若加大研究力度，將其開發成為具有改善CDDP化療期間腎功能損傷的保健食品，將會在一定程度上提高癌癥化療患者的生活質量，對癌癥的臨床治療發揮更大的作用。