輔助性T淋巴細胞17/調節性T淋巴細胞比值失衡在免疫性肝損傷大鼠模型中的變化特點

薛 苗，毛小榮，陳 紅

蘭州大學第一醫院 a.風濕免疫科; b.感染科，蘭州 730000

自身免疫性肝炎(AIH)是由自身免疫介導的主要破壞肝臟實質的炎癥性肝損傷，是一種影響全世界各種族和年齡段人群的嚴重肝病[1]。其臨床表現多樣，早期診斷極為困難。建立簡單易行、穩定可靠的AIH模型，為進一步闡明AIH病因及引起肝細胞損傷的機制提供良好的實驗基礎[2]。

介導一系列炎癥反應的輔助性T淋巴細胞(Th)17和介導免疫耐受的調節性T淋巴細胞(Treg)是與Th1、Th2細胞完全不同的CD4+T淋巴細胞系，其具有獨立的分化和調節機制[3-4]。兩者在功能和分化過程中相互拮抗，正常情況下保持平衡，有利于機體免疫穩定狀態的維持，若兩者失衡就會產生一系列免疫病理反應[5]。研究[6-8]表明，Th17/Treg及其失衡是免疫性肝損傷過程中的重要影響因素，也很有可能成為免疫治療相關疾病輔助治療的新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡健康清潔級雌性Wistar大鼠，體質量(200±20) g，購于蘭州大學醫學院動物實驗中心，飼養于蘭州大學實驗動物中心，室溫保持在(22±2)℃，相對濕度54%左右，自由進食、飲水。適應性飼養1周后，根據隨機數字表法分組。本研究方案經由蘭州大學第一醫院實驗動物倫理委員會審批(批號：LDYYLL2019-226)，符合實驗室動物管理與使用準則。

1.2 主要儀器、藥品和試劑 AU5831型全自動生化分析儀(貝克曼庫爾特，美國)，Leica CM1900 石蠟切片機、攤片、烘片機(德國 Leica 公司)，Olympus光學顯微鏡(日本)，FACSAria流式細胞儀(美國 BD公司)；刀豆蛋白A(ConA)白色凍干粉( sigma公司，美國C2010)，α-galcer(AXXORA公司，美國M0123-M005)；免疫組化試劑盒(福州邁新kit0013)，流式相關抗體及破膜劑(ebioscience公司，美國)。

1.3 建模和收集標本 將30只雌性Wistar 大鼠隨機分為3組，每組10只，標記為健康對照(HC)組、急性模型 (AC) 組和慢性模型(CC) 組。ConA溶于無菌生理鹽水，現配現用，CC組按照12.5 mg/kg劑量尾靜脈注射6周，1次/周，HC組和AC組尾靜脈注射等量的生理鹽水。第7周AC組按照40 μg/kg劑量單次尾靜脈注射α-galcer鹽水溶液，10 h后建模成功，處死。每組大鼠建模成功后，用水合氯醛麻醉，腹主動脈處取血，收集于促凝管中血液靜置后離心取血清-20 ℃冰箱保存備用，收集于抗凝管中的全血及時檢測 Th17、Treg 細胞頻率；取血后取下脾臟，除去包膜，用預先冷卻的生理鹽水沖洗干凈，剪成碎塊、充分研磨，脾臟細胞懸液上流式細胞儀檢測脾臟中Th17、Treg 細胞頻率；取肝臟組織用中性福爾馬林固定。

1.4 肝臟生化指標檢測 α-Galcer注射10 h 后，腹主動脈取血3～5 ml，室溫靜置30 min，3500 r/min，離心10 min，血清放入EP管中，-20 ℃備用。血清ALT和AST等生化指標使用蘭州大學第一醫院全自動生化分析儀檢測。

1.5 肝臟病理組織學檢查 將大鼠麻醉處死后，取出肝臟，用預冷生理鹽水沖洗3遍，用濾紙拭干。將肝組織切塊置于10%福爾馬林溶液中常溫固定48 h以上，經過一系列水洗、乙醇系列梯度脫水、透明、浸蠟、包埋后，切成厚度為4 μm的切片。將切片置于60 ℃烤箱中1 h，經過脫蠟、酒梯度脫水、蘇木精-伊紅染色、酒精梯度脫水、透明后，用中性樹膠進行封片。在光學顯微鏡下觀察各實驗組肝組織的病理學改變。

1.6 Th17細胞(CD4+IL-17+)的流式細胞術檢測 在編號的試管中加入相應大鼠0.5 ml 抗凝全血和 0.5 ml 脾細胞懸液，每管中各加入適量用1640細胞培養基稀釋后 PMA/Ionomycin/ BFA/Monensin Mixture混勻后放置于培養箱中(37 ℃，7%CO2)進行細胞刺激，4 h后將細胞懸液從培養箱中轉移至5 ml EP管中，2500 r/min離心5 min，棄上清，PBS溶液沖洗2次。然后加入5 μl FITC-抗CD4，室溫避光孵育15 min，離心，棄上清；加100 μl MEDIUMA，室溫孵育15 min，加入3 ml的PBS溶液，1000 r/min離心5 min，棄上清，渦旋振蕩，使殘留的液體重懸細胞沉淀，AC組和CC組加入100 μl MEDIUMB和20 μl PE-抗IL-17，對照組加入100 μl MEDIUMB和 10 μl PE-IgG1作為同型對照，室溫下避光反應 30 min，PBS溶液洗滌2次，1000 r/min離心 5 min，棄上清，用0.3 ml PBS將細胞沉淀重懸，于30 min內上機檢測 Th17 細胞的比率。

1.7 Treg細胞 (CD4+CD25+Foxp3+)的流式細胞術檢測 在編號的試管中加入相應大鼠0.5 ml抗凝全血和0.5 ml脾細胞懸液，每管加入5 μl FITC抗大鼠CD4單克隆抗體和5 μl APC-抗大鼠CD25單克隆抗體，室溫避光孵育 20 min，每管加入適量稀釋后RBC Lysis Buffer并混勻，室溫避光反應10 min，觀察溶液透亮后1000 r/min離心5min，棄上清。加入3 ml PBS溶液洗2次，1000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml新鮮制備的eBioscience Fixation/Permeabilization應用液，混合均勻后室溫避光孵育30 min，1000 r/min離心5 min棄上清，加2 ml Permeabilization Buffer洗滌后按照上一步驟離心，棄上清，AC、CC兩組分別加入 5 μl PE-Foxp3 抗體，HC組加入 5 μl PE-IgG2b單克隆抗體作為同型對照，室溫避光孵育30 min。用 3 ml Permeabilization Buffer洗 1次，同上一步驟離心，棄上清，用 0.3 ml PBS 將細胞沉淀重懸，于30 min內上機檢測 Treg細胞的比率。

1.8 免疫組化法觀察相關蛋白表達水平 將肝組織石蠟切片置于60 ℃烤箱 1 h后依次經二甲苯脫蠟、系列濃度乙醇水化，PBS 洗 3次后置于檸檬酸鈉緩沖液中煮沸3 min進行抗原修復，3%雙氧水和山羊血清各封閉20 min，一抗孵育，4 ℃過夜。次日復溫20 min后PBS洗3次，二抗(生物素標記的羊抗兔IgG)孵育20 min，PBS洗3次。 三抗 (辣根酶標記的鏈酶親和素)孵育，37 ℃ 20 min，PBS洗3次。DAB顯色，鏡下觀察結果。蘇木精復染5 min，自來水沖洗片刻，1%的鹽酸酒精(75%)溶液分化30 s，自來水沖洗5 min反藍。依次經過70%、 80%、90%、 95%、無水乙醇各5 min，二甲苯5 min，3次進行脫水。最后用中性樹膠封片。以上操作完成后顯微鏡下觀察Foxp3、RORγt蛋白表達水平。

1.9 統計學方法 采用 SPSS22.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 AC組、HC組大鼠活潑好動，反應靈敏，飲食良好；CC組大鼠造模2 d開始出現精神萎靡，活動少，攝食攝水減少，反應遲鈍。各組大鼠均無死亡。

2.2 肝臟生化指標檢測 與 HC 組相比，AC、CC組的血清ALT、AST、TBil水平均明顯升高(P值均<0.05)，血清Alb水平明顯降低(P值均<0.05)；與AC組相比，CC 組ALT、 TBil水平明顯升高(P值均<0.05)(表1)。

2.2 肝臟病理切片鏡下觀察 HC組顯示肝細胞排列整齊，肝小葉結構完整，表現為基本正常的肝臟組織，AC組肝臟組織鏡下表現為肝小葉壞死為主，炎性細胞浸潤，輕度肝竇擴張，大片狀壞死。CC組鏡下可見匯管區炎癥反應為主，肝細胞水腫，大量淋巴細胞浸潤，膽管反應，界面性肝炎(圖 1)。

注：a，AC組；b，CC組；c，HC組。

圖1各組大鼠肝臟組織鏡下表現(HE染色，×200)

2.3 大鼠肝臟組織中相關蛋白的表達 ROR-γt和Foxp3在3組大鼠肝臟中均有表達。細胞質、核質、細胞膜、核膜彌散分布，染色強度各不相同。在顯微鏡下定量分析免疫組織化學結果累積光密度(IOD)和陽性面積，與 HC組相比，AC組 Foxp3表達水平明顯降低，而RORγt蛋白表達水平顯著升高(P值均<0.05)；CC組Foxp3表達水平明顯升高(P<0.05)。與AC組相比，CC組Foxp3蛋白表達水平較高，而RORγt水平明顯降低(P值均<0.05)(圖2，表2)。

注：a，RORγt 在HC組的表達；b,RORγt 在AC組中的表達；c，RORγt 在CC組的表達；d，Foxp3在HC組的表達；e，Foxp3在AC組的表達；f，Foxp3在CC組的表達。

圖2大鼠肝臟中Foxp3和RORγt蛋白的表達(免疫組化，×400)

表2 3組大鼠肝臟中Foxp3和RORγt蛋白的表達比較

注：與HC組相比，1)P<0.05，與AC組相比，2)P<0.05。

表1 3組大鼠血清生化學指標比較

注： 與HC組相比，1)P<0.05； 與AC組相比，2)P<0.05。

2.4 外周血中 Th17 、Treg 細胞頻率的改變 AC 組、CC 組檢測結果與HC組相比，Th17 細胞百分率、Treg細胞百分率明顯高于HC組(P值均<0.05)，AC組Th17/Treg 比值明顯升高(P<0.05)，而CC組Th17/Treg比值與HC組相比明顯降低(P<0.05)；與AC組相比，CC組Th17細胞百分率降低，Treg 細胞百分率升高，Th17/Treg 比值降低(P值均<0.05)(表3)。

表3 3組大鼠全血中 Th17、Treg細胞頻率的比較

注： 與HC組相比，1)P< 0.05；與AC組相比，2)P<0.05。

3 討論

α-Galcer可誘導以自然殺傷T淋巴細胞特異性活化為基礎的急性肝損傷[9-10]。ConA誘導的肝炎是一種典型的T淋巴細胞介導的肝炎模型[11-12]。本研究在上述兩種建模過程中AC組和CC組血清AST、ALT與HC組相比迅速升高，表明α-Galcer、ConA作用后大鼠肝臟明顯受損；且與AC組相比，CC組ALT、TBil升高更明顯，這在肝臟病理表現中也得到了驗證。肝臟組織病理鏡下觀察發現AC組出現以肝細胞變性等急性病理變化，CC組出現了肝細胞壞死和大量炎性細胞浸潤等慢性病理改變。綜上，兩種方法均可成功建立免疫性肝損傷大鼠模型。

對Th17發育重要的STAT3已被證明抑制Foxp3的表達，而Foxp3能夠結合Th17細胞的重要轉錄因子RORγt并抑制其轉錄活性，從而抑制初始T淋巴細胞向Th17細胞方向分化發育[13-14]。實驗中免疫組化的結果顯示與HC組相比AC組的Foxp3表達水平明顯偏低，RORγt蛋白表達水平明顯上升，CC組Foxp3表達水平明顯升高；這也從分子角度驗證了AIH中確實存在Th17/Treg失衡；與AC組相比，CC組的Foxp3蛋白表達水平偏高，而RORγt水平明顯偏低，CC組表現為Treg占優勢的免疫抑制的慢性炎癥為主，Foxp3抑制RORγt轉錄活性，使初始T淋巴細胞向Treg細胞偏斜，轉錄因子的失衡可能是Th17/Treg失衡的原因。

流式細胞術結果分析顯示，AC組、CC組檢測結果與 HC 組相比，外周血中和脾臟懸液中Th17、Treg 細胞百分率明顯升高，且 AC 組 Th17/Treg 比率升高，而 CC 組 Th17/Treg 比率降低；與AC組相比，CC組Th17 細胞百分率降低，Treg 細胞百分率升高，Th17/Treg 比率降低，這個結果也與病理表現相符合，AC 組 Th17/Treg 比率明顯升高是以Th17在疾病中的促炎作用為著，在病理中表現為細胞水腫的急性病程；CC 組 Th17/Treg 比率降低表現為Treg發揮免疫抑制作用為主的慢性病程，病理表現為肝臟水腫減輕出現壞死和纖維組織增生。

本研究利用α-galcer和ConA兩種不同藥物建立急、慢性AIH大鼠模型并證實AIH中確實存在Th17/Treg及其失衡，且在炎癥反應、組織損傷中發揮了重要作用，是肝臟免疫病理反應的重要影響因素。希望可能成為免疫治療相關疾病輔助治療的靶標。