干擾素α和胸腺五肽協(xié)同干預(yù)對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞APOBEC3A和APOBEC3B mRNA表達(dá)的影響

熊 芳，高 耀，馬艷品，于樂樂，譚炳琴，鮑旭麗，閭 軍

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 肝病與腫瘤生物治療科，北京 100069

HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)是病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的一種重要復(fù)制中間體，在細(xì)胞核內(nèi)積聚，現(xiàn)有抗病毒藥物不能清除, 是肝細(xì)胞持續(xù)感染和抗病毒治療后產(chǎn)生耐受和停藥后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵[1]。既往研究[2]發(fā)現(xiàn)IFNα和胸腺五肽(thymopentin，TP5)可協(xié)同作用降低HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)cccDNA，但具體的機(jī)制未明。載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽3(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 3, APOBEC3)家族包含7位成員，包括APOBEC3A(簡(jiǎn)寫為A3A，下同)、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G和A3H，具有胞苷脫氨基活性，其中多個(gè)成員與機(jī)體抵抗病毒感染的先天性免疫有關(guān)[3]。IFNα直接作用于細(xì)胞IFNα/β受體從而上調(diào)APOBEC3A表達(dá)；而淋巴毒素β-受體(1ymphotoxin-β receptor，LTβR)特異性激動(dòng)劑可激活LTβR從而上調(diào)APOBEC3B表達(dá)。上調(diào)的APOBEC3A/B均可通過HBV核心蛋白引導(dǎo)而作用于cccDNA脫氨基作用，從而在細(xì)胞內(nèi)切酶作用下降解cccDNA[4]。本研究觀察IFNα和TP5協(xié)同干預(yù)HepG2.2.15細(xì)胞APOBEC3A、APOBEC3B基因表達(dá)水平的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 轉(zhuǎn)染HBV全基因組的人肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15細(xì)胞由本院肝病研究所保存；IFNα為人IFNα-1b注射液，購自北京三元基因工程有限公司，TP5購自北京雙鷺公司產(chǎn)品。APOBEC3A、APOBEC3B及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)引物由上海捷瑞生物工程有限公司生物公司合成。DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒購自德國Qiagen公司，plasmid safe DNase Ⅰ購自美國Epicentre公司，TRIzol試劑購自美國Sigma公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，SYBR Premix Ex Taq試劑購自日本TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2.2.15細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基加入10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(0.1 mg/ml)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞處理 取處于對(duì)數(shù)生長期的5×104個(gè)HepG2.2.15細(xì)胞接種于48孔板中，分別設(shè)立空白對(duì)照組、IFNα組、TP5組及IFNα聯(lián)合TP5組，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。分別處理12、24、48和72 h收集細(xì)胞。IFNα的濃度為2、5 KU/ml，TP5的濃度為5、10 μg/ml。

1.4 cccDNA的檢測(cè) 用DNeasy Blood & Tissue Kit提取細(xì)胞DNA, DNA經(jīng)plasmid safe DNase Ⅰ處理，利用Taqman實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)cccDNA。具體的引物和詳細(xì)方法見參考文獻(xiàn)[2]。

1.5 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)APOBEC3A、APOBEC3B的表達(dá) 應(yīng)用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。取2 μl測(cè)定樣品在260 nm和280 nm的A值，確定RNA的濃度，A260/A280比值在1.8～2.0視為抽提RNA無蛋白污染。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系如下： 5×Reverse Transcription Buffer 2 μl，RNase Inhibitor 0.5 μl，Reverse Transcriptase 0.5 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，隨機(jī)引物 1 μl，Nuclease-free water 4 μl，RNA模板(20 ng/μl) 1 μl，總反轉(zhuǎn)錄體系為10 μl。反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，-80 ℃保存。

利用SYBR實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)APOBEC3A、APOBEC3B進(jìn)行定量檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系如下：SYBR Premix Ex Taq 10 μl ，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μl，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μl，cDNA 2 μl，滅菌水7 μl，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。APOBEC3A上游引物：5′-AGATGGAGTCTGGTACTGTCG-3′，APOBEC3A下游引物：5′- GAGGCAGGAGAGTAGCGT -3′；Tm值分別為60.2 ℃、59.9 ℃，擴(kuò)增片段大小為98 bp。 APOBEC3B上游引物：5′-GACAGGGACAAGCGTATCTAAG-3′，APOBEC3B下游引物：5′-TCACTTCATAGCACAGCCAAG -3′；Tm值分別為59.5 ℃、59.8 ℃，擴(kuò)增片段大小為149 bp。 GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，GAPDH下游引物： 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGG A-3′；Tm值分別為63.0 ℃、63.1 ℃，擴(kuò)增片段大小為138 bp[4]。目的基因和內(nèi)參基因融解曲線均可見單一峰。目的基因與管家基因的擴(kuò)增效率均為99%。應(yīng)用2-△△CT法對(duì)目的片段的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFNα對(duì)APOBEC3A、APOBEC3B mRNA表達(dá)的影響

筆者前期研究[2]發(fā)現(xiàn)IFNα組可降低HepG2.2.15細(xì)胞cccDNA水平，但是只在IFNα濃度高達(dá)5 KU/ml，作用時(shí)間為24 h時(shí)明顯(圖1a)。為此，觀察了2、5 KU/ml IFNα作用于HepG2.2.15細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)APOBEC3A、APOBEC3B表達(dá)的影響。如圖2所示，2 KU/ml IFNα與空白對(duì)照組相比，在12、24、48和72 h均能提高APOBEC3A的表達(dá)水平(P值均<0.001)；5 KU/ml IFNα與空白對(duì)照組相比，在12、24、48和72 h亦能提高APOBEC3A的表達(dá)水平(P值均<0.001)。 APOBEC3B的表達(dá)水平未見升高。

注：*與空白對(duì)照組相比，P<0.001。

注：*與空白對(duì)照組相比，P<0.001。

2.2 TP5對(duì)APOBEC3A、APOBEC3B mRNA表達(dá)的影響 筆者前期研究發(fā)現(xiàn)低濃度5 μg/ml TP5組不能降低HepG2.2.15細(xì)胞cccDNA水平，而較高濃度10 μg/ml TP5組能降低HepG2.2.15細(xì)胞cccDNA含量(圖1b)。觀察了5、10 μg/ml TP5作用于HepG2.2.15細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)APOBEC3A、APOBEC3B表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比未見明顯變化(P值均>0.05)(圖3)。APOBEC3B的表達(dá)未見變化。

圖3 不同濃度TP5干預(yù)對(duì)APOBEC3A mRNA水平的影響

2.3 IFNα聯(lián)合TP5對(duì)APOBEC3A、APOBEC3B mRNA表達(dá)的影響 筆者前期研究發(fā)現(xiàn)2 KU/ml IFNα聯(lián)合5、10 μg/ml TP5組作用于HepG2.2.15細(xì)胞72 h可顯著降低cccDNA水平(圖1c)。觀察了2 KU/ml IFNα聯(lián)合5、10 μg/ml TP5組作用于HepG2.2.15細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)APOBEC3A、APOBEC3B表達(dá)的影響。如圖4所示，2 KU/ml IFNα聯(lián)合5 μg/ml TP5與空白對(duì)照組相比,在12、24、48和72 h均能提高APOBEC3A的表達(dá)水平(P值均<0.001)；2 KU/ml IFNα聯(lián)合10 μg/ml TP5與空白對(duì)照組相比，在12、24、48和72 h亦能提高APOBEC3A的表達(dá)水平(P值均<0.001)；與2 KU/ml IFNα相比，2 KU/ml IFNα聯(lián)合5 μg/ml TP5組和2 KU/ml IFNα聯(lián)合10 μg/ml TP5組在12、24、48和72 h均可明顯提高APOBEC3A的表達(dá)水平(P值均<0.001)。APOBEC3B mRNA表達(dá)未見變化。

3 討論

筆者前期研究[2]發(fā)現(xiàn)IFNα和TP5可協(xié)同作用降低HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)cccDNA，具體的機(jī)制未知。本研究表明IFNα聯(lián)合TP5可作用于HepG2.2.15細(xì)胞，顯著提高APOBEC3A的表達(dá)來降解cccDNA。為臨床上TP5聯(lián)合IFNα的抗HBV作用提供了新機(jī)制。

注：*與空白對(duì)照組相比，P<0.001；#與2 KU/ml IFNα組相比，P<0.001。

APOBEC3A、APOBEC3B屬于APOBEC3家族，是一類可抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的酶。APOBEC3家族的所有成員都具有脫氨基作用。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)表明IFNα可以誘導(dǎo)部分APOBECs表達(dá)上調(diào)[5-7]。研究[8]表明IFNα可通過上調(diào)APOBEC3A的表達(dá)來發(fā)揮對(duì)HBV cccDNA的脫氨基作用，在cccDNA上形成脫嘌呤嘧啶位點(diǎn)，使得cccDNA被核酸裂解酶識(shí)別而降解，從而顯著降低細(xì)胞內(nèi)cccDNA。但是這種作用，在IFNα較高濃度時(shí)明顯。

本研究發(fā)現(xiàn)低濃度的TP5單獨(dú)對(duì)細(xì)胞內(nèi)APOBEC3A的表達(dá)并無影響。TP5降低cccDNA的具體機(jī)制可能不是通過提高細(xì)胞內(nèi)APOBEC3A這條通路，具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。但是TP5聯(lián)合IFNα可顯著提高細(xì)胞內(nèi)APOBEC3A mRNA的表達(dá)，與IFNα單獨(dú)提高APOBEC3A的表達(dá)相比，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。提示在臨床實(shí)踐中，TP5聯(lián)合IFNα對(duì)HBV的治療是有益的。但是本實(shí)驗(yàn)方法只是局限于real-time PCR方法所測(cè)，可進(jìn)一步完善蛋白水平檢測(cè)數(shù)據(jù)和基因沉默實(shí)驗(yàn)，將會(huì)使結(jié)果更加全面。

TP5是一類免疫調(diào)節(jié)劑，可增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能，在我國廣泛用于慢性乙型肝炎的治療。可增強(qiáng)慢性肝炎患者CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞成熟及分化，改善T淋巴細(xì)胞亞群水平及比例，通過增加CD4+/CD8+比值并延長細(xì)胞亞群的壽命，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，通過活化輔助性T淋巴細(xì)胞并誘導(dǎo)抑制性T淋巴細(xì)胞來發(fā)揮作用[9]。本研究表明，TP5和IFNα的聯(lián)合作用可降解cccDNA, 其中一個(gè)的機(jī)制是通過協(xié)同作用提高細(xì)胞內(nèi)APOBEC3A mRNA的表達(dá)。