快速光響應曲線的優化及在底棲甲藻光適應特性研究中的應用

黃凱旋, 陳 亨, 徐帥帥, 劉莎莎, 呂頌輝

(暨南大學 赤潮與海洋生物學研究中心, 廣東 廣州 510632)

底棲甲藻(benthic dinoflagellate)是指附著在海洋基底, 如沙礫、珊瑚、大型海藻、巖石等基質上的甲藻生態類群[1]。野外調查發現水深0~5 m是底棲甲藻豐度最高區域[2], 這一區域因潮汐周期存在著復雜多變的光場。因此, 底棲甲藻的一個重要的挑戰是避免強光照射造成光損傷。在長期演變中, 藻類進化出一系列保護機制適應強光照射, 其中非光化學淬滅(non-photochemical quench, NPQ)起到了重要的作用[3]。

NPQ主要是由葉黃素循環, 通過去環氧化過程將部分光能以無損害的熱能形式耗散[4]。硅甲藻黃素循環是在甲藻和硅藻NPQ中已知的起到重要作用的葉黃素循環, 占據將近90%的非光化能耗散[5]。該循環一個重要特點是較小的ΔpH差就可以驅動硅甲藻黃素的去環氧化[6]。因此相對于高等植物, 硅藻和甲藻的NPQ所需的光強更小, 并且誘導時間也更短[7-8]。此外, 黑暗或低光條件, 部分底棲硅藻的NPQ不會完全釋放, 甚至出現上升的情況, 稱之為黑暗NPQ (dark NPQ)[9], 類似的情況同樣在底棲甲藻中發現。通過以上不同的葉黃素循環機制, 使得硅甲藻的NPQ過程變得更為靈活, 能快速的響應光環境變化[10]。

Beer等[11]發現光化反應下的電子傳遞速率(electronic transport rate, ETR)與O2或CO2代謝有著密切的關系。以ETR繪制的光合作用曲線, 稱為快速光響應曲線(rapid light curves, RLCs), 類似于以光合放氧為基礎的曲線。RLCs由一組上升的光強梯度組成, 通過葉綠素熒光技術進行測定, 其中每個光強梯度一般不超過60 s, 整個過程不超過10 min, 因此適用于快速變化的光場[12]。RLCs能夠反映光合生物的長期或短期的光適應情況, 因此RLCs在野外調查中已經有廣泛的應用, 在大型海藻[13], 底棲微藻[14]和珊瑚[15]等底棲生物的調查中均起到重要的作用。但RLCs的測定中存在內生的光適應, 能夠改變葉綠素a熒光的激發, 進而導致ETR測定產生偏離。如初始PSII電子受體醌受體A(QA)的氧化或NPQ在RLCs測定過程中產生光適應,影響了熒光的測定, 甚至由于過高的NPQ導致曲線不飽和情況。Perkins等[16]提出用反序的光強梯度, 即光強下降的順序用于底棲硅藻的RLCs測定, 能一定程度降低內生光合作用變化的影響, 更為真實的反映實際光合作用狀態。非序光曲線(non-sequence light curves, N-SLCs)是每一個光梯度均用單獨的, 未經任何測定的樣品進行測定光曲線, 并且光梯度的測定無需按照順序進行測定[16-17]。由于每一個光梯度的樣品均是獨立的, 能基本去除內生光適應效應。

本研究目標是優化RLCs程序, 減少RLCs內生偏差, 改善RLCs技術在底棲甲藻的應用。Coolia (Ostreopsidaceae, Dinophyceae)是全球分布并具有潛在毒性的底棲甲藻, 在我國亞熱帶海域廣泛分布[18]。本文選用Coolia tropicalis, 通過不同光背景短期馴化的細胞, 分別測定不同光序列結構和不同光梯度時長的RLCs, 對比N-SLCs, 進而評估RLCs光曲線過程中誘導的快速光適應的積累和反序RLCs的可行性。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

藻種Coolia tropicalis分離自海南島, 保種于暨南大學赤潮與海洋生物研究中心。細胞培養在f/2培養基加富的自然海水中, 培養溫度為25℃, 光強為100 μmol photons/(m2·s)(12 h/12 h, 光暗周期), 光強度由光度計QSI2100 (Biospherical Instrument Inc., USA)測定。取處于指數生長期的細胞進行后續實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 快速光響應曲線測定

60 mL藻液分裝在玻璃試管(高20 cm, 半徑2 cm)中, 在LED(150 W)下照射60 min, 通過試管包裹不同層數的中性網獲得不同光強(210, 350, 400, 500, 800, 1 000 μmol photons /(m2·s)), 其中210和1 000 μmol photons/(m2·s)分別記作LL和HL用于顯示的RLCs曲線和NPQ誘導曲線結果。照射期間, 由循環水控溫裝置CA-1111(EYELA, Japan)進行控溫(25 )℃。取1 mL樣品于2 mL棕色離心管中黑暗15 min, 隨后測定快速光響應曲線。

使用浮游植物分析儀Phyto-PAM(Walz, Germany)對葉綠素熒光進行測定, 共設置64, 164, 264, 464, 664, 864, 1 264, 1 664和2 064 μmol photons/(m2·s) 9個光化光步數, 每個光化光步長(即照射時間)為10, 30或60 s, 光化光序列采用3種序列, (1)正序(Up), 即光化光強度從低到高順序; (2)反序(Down), 即光化光強度從高到低順序; (3)非序(NS), 即每個光化光強度均由單獨的樣品進行測定, 不存在先后順序。每個序列3個重復, 由3次獨立實驗完成。

1.2.2 葉綠素熒光參數

每一個光化光強度, 有效光化學效率(Yield’)由調制式飽和脈沖技術測定。200 ms、4 000 μmol photons/(m2·s)飽和脈沖能夠將光系統II(PSII)受體側完全處于還原態, 誘導實時熒光(F′)升高至最大熒光(Fm′):

Phyto-PAM提供4個波段的Yield’, 選取波段470 nm(由于甲藻含有葉綠素c和類胡蘿卜素, 520 nm同樣也激發)的Yield’值用于計算相對電子傳遞速率(rETR):

式中1/2代表兩個光系統平分一個光子, PAR為光化光強度。

非光化學淬滅(NPQ)計算公式為:

硅甲藻黃素-硅藻黃素色素循環依賴的NPQ在黑暗中依舊能夠維持黑暗NPQ如通過葉綠體呼吸(chlororespiration)途徑。暗適應測定的最大熒光產量Fm不能夠體現真實值。因此 NPQ計算用RLCs中的最大熒光產率Fm′max替代Fm[16]。

Phyto-PAM一個Gain水平上最高記錄1 870 units, Fm或Fm′超過1 870 units都記錄為1 870 units; 而在RLCs誘導過程中, Fm′信號低于100 units則會出現過載。因此, 過高或過低的F′信號都會導致NPQ值出現偏差。根據藻種的特性, 通過Gian的調整, 獲得大約500~600 units, F′信號可避免上述情況的發生。

1.3 統計分析

根據文獻[19], RLCs由公式(5)進行擬合。

式中Ps是與最大相對電子傳遞速率(rETRmax)相關參數, I為光化光強度, α為初始斜率, β為抑制率。

數據由SPSS16.0的One-way Anova的Tukey或Duncan法進行統計分析, P<0.05為顯著。

2 結果

2.1 快速光響應曲線

如圖1所示, 在LL(210 μmol photons/(m2·s))和HL(1000 μmol photons/(m2·s))光強條件馴化下, 非序和反序RLCs分別在光強664和864 μmol photons/ (m2·s)之后出現了光飽和或光抑制, 而正序RLCs并未出現光飽和或光抑制點。各RLCs序列的30 s和60 s的rETR之間無顯著差異(P>0.05), 二者均顯著高于10 s的rETR(HL的反序RLCs除外)(P<0.05)。 巧合的是, HL馴化下的反序和非序RLCs在30 s和60 s的曲線幾乎重合(圖1 d, f)。

圖1 步長和光序列對RLCs的影響 Fig. 1 Impact of light duration and sequence on rapid light curves

2.2 光合生理參數

對從6種光背景處理的光曲線所得出的α, rETRmax和Ek進行趨勢比較(圖2)。非序RLCs的α總體趨勢呈現隨光強的升高而降低, 其中60 s的顯著高于10 s和30 s的(P<0.05)(圖2 a, b, c)。反序和正序RLCs的α值高于非序RLCs(P<0.05), 并且在同一步長下表現相似的趨勢。其中10 s的趨勢與30 s和60 s的不同, 呈現出隨光強升高而先升高后降低的趨勢, 且反序RLCs的α顯著高于正序(P<0.05)。

三種序列的rETRmax值的排序為: 正序RLCs>反序RLCs>N-SLCs(P<0.05)。非序RLCs的rETRmax也隨著光強的升高而降低, 其中10 s的顯著低于30 s和60 s的(P<0.05)(圖2 d, e, f)。正反序RLCs的rETRmax趨勢為隨光強升高先輕微上升后下降。步長為30 s和60 s的正反序RLCs的rETRmax無顯著差異(P>0.05), 且均高于10 s(P<0.05)。

三種序列RLCs的α和rETRmax總體而言的趨勢是相似的, 但由rETRmax/α所得出的Ek趨勢出現分化(圖2 g, h, i)。30 s和60 s正序RLCs的Ek隨光強升高而升高, 與10 s的趨勢相反。非序和反序RLCs的Ek在光化光超過500 μmol photons/(m2·s)呈現下降趨勢(10 s, LL反序RLCs結果除外, 圖2 g), 在此之前維持不變或上升趨勢。

2.3 NPQ動力曲線

NPQ動力曲線受到序列方式和步長的影響。其中反序RLCs的曲線與正序和非序完全不同, 其存在3個階段的變化: 第一階段為光強降低, 但光強較強足以誘導NPQ, 呈現NPQ隨光強降低而升高; 第二階段為光強繼續降低, 當光強不足以維持最大NPQ時, NPQ隨光強降低而降低; 第三階段為由于葉綠體呼吸在低光強下NPQ重新上升。由于HL馴化下的NPQ所需誘導的光強強度更低, 所以曲線并未顯示出第二階段(圖3 d)。正序和非序RLCs的NPQ均呈現隨光強升高而升高的趨勢, 但正序RLCs的NPQ上升速度遠高于非序RLCs。

正序RLCs在高光強部分的NPQ顯著高于反序和非序的(P<0.05)。正序RLCs的NPQ在光強2 064 μmol photons/(m2·s)時達到最大, 比較三種序列在此光強的NPQ, 正序RLCs步長10 s, 30 s和60 s 的NPQ在LL下分別為反序的2.86, 3.05和3.03倍, 是非序的3.21, 3.21和4.11倍; 在HL下為反序的1.64, 3.74和3.25倍, 是非序的5.74, 8.96和13.06倍。

圖2 步長和光序列對光合參數的影響 Fig. 2 Impact of light duration and sequence on the parameters of RLC

3 討論

本文設置在不同光背景馴化下, 對不同光序和步長的光曲線進行比較, 目的是探究RLC曲線中內在光適應是否會影響底棲甲藻的葉綠素熒光的測定, 進而改變RLCs的結果以及由此衍生的光合生理參數。而這些結果牽涉到兩個光適應階段: 一是RLCs測定前的不同光背景馴化所導致的光適應, 也正是光曲線所測定的光適應類型; 二是在RLC期間的光適應, 而這是RLCs技術應當避免的。因此, 如果假設成立, 為更好反映光背景下的光適應, 減小RLCs期間內部光適應是必要的。

圖3 步長和光序列對NPQ動力學曲線的影響 Fig. 3 Impact of light duration and sequence on NPQ kinetic curves

3.1 NPQ的影響因素與對光曲線的影響

NPQ是底棲光合生物重要的光保護機制之一, 同時也是對光環境適應的必要途徑[20]。基于NPQ的特性, 是依靠光照所造成的的類囊體質子梯度的構建來驅動葉黃素循環進行熱能耗散。測定RLCs期間光化光的照射不可避免的誘導NPQ的產生, 而NPQ在序列內的強弱決定了序列內光適應程度[21]。

NPQ的強弱受到步長和光化光序列方式影響。步長的延長會導致NPQ的升高, 依照最小化序列內光適應的原則, 步長應盡可能的短暫, 但同時需要考慮其他的因素。步長為10 s會造成正反序RLCs的rETRmax和Ek的低估。在phyto-PAM參數設定優化中, rETRmax和Ek基本在30 s達到穩定, 與本文的結果基本一致[22]。此外, 在反序RLCs中使用步長10 s時, 由于前序NPQ累積和葉綠體呼吸導致NPQ的上升, 造成α的高估(圖2a)。因此推薦使用步長30 s進行RLCs測定。

采用非序RLCs的方式, 每個光化光的NPQ均由獨立的樣品測定, 可獲得最小NPQ強度和無序列內光適應, 較為真實的反映光馴化下的光適應。因此可將其結果作為標準對正反序RLCs的結果進行比較。正序RLCs的NPQ由于連續光化光的刺激, 上升速度遠高于非序RLCs。在非序RLCs已經達到光飽和或光抑制光強時, 正序RLCs由于已累積較高NPQ值, 使得rETR能夠繼續上升, 造成曲線的不飽和。反序RLCs的NPQ由于在高光強部分沒有前序累積, 處于較低的數值, 比如在2 064 μmol photons/(m2·s)時為正序RLCs的1/3左右。因此曲線有光飽和或光抑制的體現, 并且在HL的30 s和60 s時幾乎與非序RLCs重合。因此, 反序RLCs在控制RLCs序列內光適應和反映光背景馴化的光適應方面優于正序RLCs。

3.2 光合生理參數對光適應的反映

由光曲線獲得光合作用參數已經在多種光合生物的野外和室內研究中用于反映短期或長期的光適應狀態[15,23]。C. tropicalis在低于500 μmol photons/(m2·s)時的α和rETRmax基本維持不變甚至呈現上升趨勢, 當光強超過500光強時, α和rETRmax均呈現下降趨勢。α為光利用效率, 為光捕獲系統向光反應中心PSII傳遞光能的比率; 而rETR和卡爾文循環有著密切的聯系, rETRmax可反映卡爾文循環的最大能力[24]。Pniewski 等[25]利用RLCs技術在底棲微藻的調查中觀察到長期適應低光環境的細胞在高光強下α和rETRmax均下降; 而長期接觸高光環境的細胞在高光條件下rETRmax仍能夠升高。比較本研究的結果, 說明了C. tropicalis在一定光強范圍內能夠提升卡爾文循環來加速電子的傳遞, 但過高的光強在1 h光馴化中超出最適范圍, 甚至可能存在光抑制。在反序和非序RLCs步長30 s和60 s結果中, 當馴化光強低于500 μmol photons /(m2·s)時Ek維持不變或上升趨勢, 其值在450~650 μmol photons/(m2·s)范圍之間; 而超過500 μmol photons /(m2·s)之后呈現下降趨勢。Ek反映細胞的最大最適光強, 這一趨勢和數值均與上述的結論相一致。但在30 s和60 s正序RLCs中, Ek隨馴化光強升高而升高, 且其值也遠超反序和非序RLCs的結果, 存在嚴重的高估。

4 結論

普通正序RLCs在反映底棲甲藻C. tropicalis的光合狀態時, 由于測定序列內NPQ的快速累積, 造成曲線的不飽和和光合參數Ek的高估。采用反序RLCs可減緩序列內NPQ的累積問題, 尤其在高光化光部分。曲線結果可觀察到光飽和或光抑制, 反映光背景的光合參數趨勢也與非序RLCs的結果基本一致。在反序RLCs中, 步長10 s時對α存在高估, 而對rETRmax和Ek的低估, 在步長30 s時各項參數基本達到穩定。在今后底棲甲藻的光合生理研究中, 如RLCs出現曲線不飽和現象, 可考慮采用30 s反序RLCs進行測定。