急性熱應激對大菱鲆血液生化指標的影響

孟 振, 張鴻麗, 劉新富, 賈玉東, 劉 濱, 曲江波

(1. 中國水產科學研究院 黃海水產研究所 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室, 山東 青島 266071; 2. 暨南大學 赤潮與海洋生物學研究中心, 廣東 廣州 510632; 3. 煙臺開發區天源水產有限公司, 山東 煙臺 264006)

溫度是水產養殖中最關鍵的環境因素之一, 養殖水溫的任何變化都可能影響魚類的行為、生化和正常生理活動[1-3]。已有研究表明, 熱應激會對魚類產生不利影響, 包括代謝紊亂[4,5]、氧化應激[6,7]、免疫力和抗病力的急劇下降[8,9]等。血液作為魚類循環系統重要的組成部分, 高溫脅迫引發的神經內分泌調節、內環境穩態失衡等變化會在魚類血液指標上有所體現, 同時血液生理生化指標也能夠客觀地反映機體的應激狀態和抗應激調控機制, 血液理化指標也由此被廣泛應用于評估魚類生理健康程度和對環境的適應能力[10-12]。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是一種冷溫性比目魚(Pleuronectiformes)類, 現已發展成為中國、歐洲和美洲的重要海水養殖品種。適應低水溫生活和生長是其突出特點, 實踐證明對于10~15 cm的大規格魚種, 在5℃的水溫條件下仍可保持較積極的攝食狀態, 其最適生長水溫在13℃~20℃, 而且隨苗種規格的增加, 其最適生長水溫范圍不斷降低, 長期處于23℃以上水溫條件下影響其生長率和成活率[13,14]。當前, 中國大菱鲆養殖模式主要為室內工廠化和網箱養殖, 養殖范圍由北方的環渤海三省一市輻射至福建沿海, 而且因其相對完整的產業鏈條、養殖效益和市場認可度, 又是未來深遠海養殖的最佳適養品種。在全球氣候變暖和極端天氣頻發的情況下, 夏季高溫已成為威脅大菱鲆健康養殖的重要因素。高溫應激對大菱鲆的影響近年來也引起研究者的重視, 應激標志物的選擇主要集中于體表黏液[15]和氧化應激指標[16], 缺乏對血液理化指標的廣泛調研。

本研究通過急性熱應激, 檢測溫度和時間雙因素作用下血液神經內分泌激素、血糖、抗氧化和非特異性免疫指標的動態變化, 以期分析大菱鲆響應熱應激的反應策略和抗熱應激調控機制, 為大菱鲆耐高溫選育和養殖中發展抗高溫調控措施提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗在煙臺開發區天源水產有限公司進行, 幼魚為公司培育的全同胞苗種, 苗種培育馴化溫度為18±1℃, 規格為全長21.98 cm±0.53 cm、體質量183.65 g± 15.99 g。選擇體質健壯、活力強、規格整齊的幼魚, 實驗前在實驗水槽暫養48 h, 水溫18±0.5℃, 暫養期間不投餌。

1.2 實驗條件及控溫方式

實驗水槽實際水體300 L, 實驗用水為紫外線消毒的砂濾海水, pH 7.85, 鹽度29.5, TAN<0.1 mg/L。溫度以鈦加熱棒(1 000 W)和控溫儀(HXSWT-210, 大連匯新鈦設備開發有限公司)控制, 控溫精度±0.5℃, 實驗期間微流水(換水量約3次/d), 正常充氣, 保持溶氧6.5 mg/L以上。

1.3 高起始致死溫度

設定18℃、21℃、24℃和27℃ 4個溫度梯度, 每個溫度設置3個平行樣, 每個平行樣放入同規格大菱鲆幼魚10尾, 初始溫度為18±0.5℃過濾海水, 按1℃/h的升溫速率, 升到預設溫度, 以溫度達到預設值為時間零點, 進行96 h高溫脅迫實驗, 實驗結束后統計各溫度組實驗魚累計死亡率, 利用Probit 回歸分析獲得96 h死亡率達到50%的溫度值, 作為大菱鲆大規格苗種高起始致死溫度(96 h UILT50, Upper Incipient Lethal Temperature 50)[17]。實驗期間不投餌, 觀察記錄大菱鲆的行為反應, 每4 h測量1次水溫、溶解氧和pH, 每24 h記錄各平行樣死亡個體數量, 并及時剔除死亡個體, 魚體死亡以碰觸15 s內無反應為準。

1.4 熱應激試驗

采用上述溫度梯度及實驗操作, 評估熱應激對大菱鲆大規格幼魚血液生化指標的影響, 每個試驗組設3個平行樣, 每個平行樣放入上述同規格大菱鲆幼魚30尾。

1.4.1 血液樣品采集

在脅迫試驗的0、3、6、9、12、24、48、72和96 h隨機取樣采血, 每次每組平行樣各隨機取樣2尾, 共6尾魚。采血后將魚體放入暫養池, 不再放回原試驗水槽, 以避免對同一條魚重復取樣。

為減少采血操作對結果的影響, 取樣時將魚迅速撈起, 并立即投入質量濃度為200 mg/L的MS-222海水中進行快速深度麻醉(10 s~15 s碰觸無反應), 尾靜脈釆血。采血注射器及離心管均用20 μL的1%肝素鈉溶液浸潤、烘干、冷卻后使用。采集血樣在4℃保溫箱中靜置, 以4℃、4 000 r/min離心10 min制備血漿, 血漿于–80℃冰箱中保存備用。

1.4.2 血液樣品分析

使用Elisa法(上海酶聯, 中國)測定血漿皮質醇(Cortisol, Fish Cortisol Elisa Kit ml003467)和腎上腺素(EPI, Fish EPI Elisa Kit ml920078)濃度; 使用微量酶標法(南京建成, 中國)檢測血漿堿性磷酸酶(AKP)和還原型谷胱甘肽(GSH)濃度/活性; 使用羥胺法(南京建成, 中國)檢測血漿超氧化物歧化酶(SOD)活性; 使用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(南京建成, 中國)檢測血漿葡萄糖(GLU)濃度。操作方法參照試劑盒說明書。

1.5 數據分析

大菱鲆96 h的UILT50和95%可信區間使用SPSS 17.0軟件以概率單位加權回歸(Probit)法求出。血漿生化指標數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示, 利用SPSS 17.0軟件雙因素方差分析(Two-way ANOVA)進行檢驗, 并采用Tukey’s多重比較分析同一溫度不同時間和同一時間不同溫度組間的差異, P<0.05表示顯著性差異。

2 結果

2.1 行為反應

大菱鲆大規格幼魚對急性熱應激脅迫產生明顯的行為反應, 高溫組魚體行為響應時間提前, 反應程度劇烈。對照組(18℃)大菱鲆整個試驗周期都相對安靜伏底, 泳速、泳態正常, 體色無明顯變化; 21℃組實驗初期(0~12 h)魚體相對安靜, 24 h后游泳頻率高于18℃組, 泳速、泳態、體色正常; 24℃組實驗早期(12 h)魚體即表現煩躁, 游動頻繁, 尤其喜歡向水面游動, 后期體色變淺, 體表特有的色素斑點更加明顯; 27℃組實驗早期(9 h)魚體不停在中上水層游動, 易受驚嚇, 體色明顯變淺, 同時體表色素斑點突出; 高溫組(24℃、27℃)實驗后期魚體運動頻率明顯下降, 且有不同比例的個體反應遲鈍, 死亡個體癥狀表現為口張大或微張, 鰓蓋閉合。

2.2 高起始致死溫度(UILT50)

對照組96 h內實驗魚全部存活, 無異常反應。其他實驗組升溫過程中(升溫時長3 h~9 h)均未發現死亡現象, 急性熱應激對大菱鲆的致死效應見表1, 21℃組僅1尾個體在48 h內出現死亡, 24℃和27℃組在24 h~96 h內有不同比例的死亡率, 死亡率隨溫度升高不斷上升。SPSS 17.0軟件以概率單位加權回歸(Probit)法求出大菱鲆96 h的高起始致死溫度為28.05℃, 95%置信區間為26.52℃~31.84℃。

表1 大菱鲆的急性高溫脅迫致死效應和高起始致死溫度 Tab. 1 Acute temperature stress and upper incipient lethal temperature 50 (UILT50) leads to lethality in juvenile turbot

2.3 對血液生化指標的影響

2.3.1 對神經內分泌調節的影響

溫度和脅迫時間均對大菱鲆血漿腎上腺素(EPI)含量變化有顯著影響, 且兩者存在顯著的交互作用(圖1)。同一溫度下, 除18℃組外, 熱應激組血漿EPI含量隨脅迫時間的延長均呈現逐漸上升的趨勢; 同一脅迫時間, 21℃組血漿EPI含量自12 h后始終維持最高值, 且顯著高于對照組(P<0.05), 24℃和27℃組EPI含量則基本與對照組相當, 實驗早期(6 h~12 h)則顯著低于對照組水平(P<0.05)。

血漿皮質醇(Cortisol)含量受溫度、脅迫時間和兩者交互作用的顯著影響(圖2)。18℃組血漿血漿皮質醇含量始終維持較低的水平, 熱應激組血漿血漿皮質醇含量隨脅迫時間延長呈現先升后降的趨勢, 均在48 h達到最高值; 同一脅迫時間, 24℃和27℃組血漿皮質醇含量隨溫度變化響應時間相應提前, 于脅迫后3 h或6 h即顯著高于對照組(P<0.05), 21℃組血漿血漿皮質醇含量響應時間滯后, 至脅迫后9 h顯著高于對照組(P<0.05), 24 h和48 h含量也顯著高于24℃和27℃組(P<0.05), 達對照組2倍多。

圖1 急性溫度脅迫對大菱鲆血漿腎上腺素含量的影響 Fig. 1 Effect of acute temperature pressure on plasma EPI content in turbot

2.3.2 對血糖含量的影響

血漿血糖(GLU)含量受溫度、脅迫時間及交互作 用的顯著影響(圖3)。同一溫度條件下, 18℃組GLU含量維持相對一致的表達水平, 實驗后期GLU含量略微下降, 但差異不顯著(P>0.05); 21℃組血糖含量隨脅迫時間呈現逐漸升高的趨勢, 48 h后GLU含量顯著高于脅迫前(P<0.05); 高溫組(24℃和27℃)GLU含量隨脅迫時間呈先升后降的趨勢, 3 h~9 h即顯著高于脅迫前, 至96 h下降至最低值。同一脅迫時間下, GLU含量與溫度有關, 實驗早期(0~24 h), GLU含量與溫度呈正相關, 27℃組快速(6 h)達到最高值, 約為對照組的1.5倍, 實驗后期(48 h~96 h), 熱應激組GLU含量與溫度呈負相關, 21℃組GLU含量處于最高值, 而24℃和27℃組GLU則快速下降至極低水平, 顯著低于21℃組(P<0.05)。

2.3.3 對氧化應激參數的影響

溫度和脅迫時間顯著影響血漿還原型谷胱甘肽(GSH)的含量變化, 但兩者無顯著性交互作用(圖4)。同一溫度下, 18℃組血漿GSH實驗周期內無顯著性變化, 21℃組除48 h顯著降低外, 其他時間也沒有顯著性變化, 24℃和27℃組GSH含量則隨時間延長逐漸降低, 脅迫初期(0~3 h)顯著高于脅迫后期(24 h或96 h后)(P<0.05)。同一脅迫時間下, 4個溫度組僅脅迫起始時(0 h), 27℃組血漿GSH含量顯著高于其他實驗組(P<0.05), 此后, 各溫度組血漿GSH含量無顯著性差異(P>0.05)。

血漿超氧化物歧化酶(SOD)活性受溫度、時間及交互作用的顯著影響(圖5), 其影響作用主要表現在脅迫初期, 在脅迫0~3 h內血漿SOD活性與溫度呈正相關, 且隨脅迫時間延長而升高(P<0.05), 脅迫6 h后, 各溫度組和各脅迫時間除個別點外, 均無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 急性溫度脅迫對大菱鲆血漿皮質醇含量的影響 Fig. 2 Effect of acute temperature pressure on plasma Cortisol content in turbot

圖3 急性溫度脅迫對大菱鲆血漿葡萄糖含量的影響 Fig. 3 Effect of acute temperature pressure on plasma GLU content in turbot

圖4 急性溫度脅迫對大菱鲆血漿還原型谷胱甘肽含量的影響 Fig. 4 Effect of acute temperature pressure on plasma GSH content in turbot

圖5 急性溫度脅迫對大菱鲆血漿超氧化物歧化酶活性的影響 Fig. 5 Effect of acute temperature pressure on plasma SOD activity in turbot

2.3.4 對非特異性免疫能力的影響

血漿堿性磷酸酶(AKP)活性受溫度、脅迫時間及交互作用的顯著影響(圖6)。同一溫度下, 18℃組和21℃組AKP活性96 h內無顯著性變化, 24℃和27℃組在24 h內也無顯著性變化, 24 h后隨脅迫時間延長逐漸升高。同一脅迫時間, 熱應激組AKP活性在9 h內稍低于對照組, 差異不顯著(P>0.05), 12 h顯著低于對照組AKP活性(P<0.05), 48 h后熱應激組AKP活性則顯著高于對照組(P<0.05), 且升高幅度與溫度呈正相關。

3 討論

魚類作為變溫動物, 環境溫度變化直接影響機體的新陳代謝過程, 適溫范圍內溫度升高, 魚類游泳、呼吸頻率、攝食等行為強度增大, 生理活動增強, 代謝旺盛, 但溫度超過其適溫范圍, 則會導致代謝紊亂, 直至機體死亡[18]。作者通過高溫脅迫實驗, 對大菱鲆幼魚死亡率和行為反應進行比較, 結果表明: 在18℃馴養溫度和1℃/h的升溫速率下, 熱應激組(24℃和27℃)大菱鲆實驗早期均表現出游動頻繁、煩躁和呼吸急促的特點, 而后期則逐漸降低游動頻率, 直至喪失躲避風險的能力, 96 h高起始致死溫度(UILT50)為28.05℃。大菱鲆對急性熱應激的行為反應與大黃魚(Larimichthys crocea)[19]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[20]等游泳性魚類相似, UILT50低于許氏平鲉(Sebastes schlegelii)和大瀧六線魚(Hexagrammos otakii)等冷溫性魚類[17], 但稍高于木云雷[21]等報道的大菱鲆稚魚24 h UILT50(26.54℃), 這可能與不同的升溫方式有關, 作者采用1℃/h的升溫速率, 而后者采用了突變高溫脅迫的方法, 多數研究也已證實同種魚類UILT50受到個體因素、馴化溫度、升溫速 率和水質條件等多種因素的協同作用[3,17]。

圖6 急性溫度脅迫對大菱鲆血漿堿性磷酸酶活性的影響 Fig. 6 Effect of acute temperature pressure on plasma AKP activity in turbot

Bartons[22]把魚類對環境壓力應激的初級階段定義為神經內分泌反應, 有兩條內分泌調節途徑, 一是交感-嗜鉻組織系統, 常被急性脅迫激活, 特別是應激伴隨或者涉及血氧含量的顯著降低, 通過釋放腎臟嗜鉻細胞組織中儲存的兒茶酚胺類激素, 導致血漿兒茶酚胺、腎上腺素和去甲腎上腺素水平的快速增加[23]。二是下丘腦-垂體-腎間組織軸(HPI軸), 激活下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、垂體促腎上腺皮質激素(ACTH)、腎間組織皮質類固醇激素的級聯釋放, 導致血漿皮質醇含量的升高[24]。已有研究表明, 溫度急性應激導致虹鱒[25]、許氏平鲉[26]、大黃魚[19]和裂腹魚(Schizothorax prenanti)[27]等多種魚類皮質醇的短期快速升高, 皮質醇也因此被認為是魚類溫度應激反應的初始指示器[11,28]。本研究中, 同其他魚類一樣, 急性熱應激組大菱鲆血漿皮質醇快速升高, 脅迫初期皮質醇升高的響應時間與溫度明顯相關, 溫度越高, 響應時間提前, 血漿皮質醇含量隨脅迫時間延長呈現先升后降的趨勢, 各脅迫組均在24 h~48 h達到最高值, 至96 h仍顯著高于對照組。血漿EPI含量則未表現類似的趨勢, 高溫組(24℃和27℃)含量脅迫早期(6 h~12 h)顯著低于對照組, 而其他時間與對照組無顯著差異, 僅21℃組48 h后顯著高于對照組。由此推測, HPI軸調節作用在大菱鲆急性溫度脅迫反應中其主導作用, 血漿皮質醇可以作為溫度應激反應的內分泌激素標志物。本實驗中血漿皮質醇含量的變化規律也表明, 對于24℃和27℃熱應激組在脅迫初期(3 h~6 h)檢測血液血漿皮質醇含量即可準確體現大菱鲆的應激狀態, 而21℃組則需推遲至9 h以后, 以24 h~48 h的含量作為敏感指標最為有效, 血漿皮質醇變化規律也與大菱鲆行為變化相對應, 24℃和27℃熱應激組在脅迫初期(0~12 h)即表現出游動頻繁、煩躁不安的應激狀態, 血漿皮質醇含量也相應升高, 21℃組則在24 h后才表現出游動頻繁的特點, 血漿皮質醇含量響應時間則相對滯后。

血糖(GLU)是魚類最重要的能源物質, 主要來源于肝糖原分解和糖異生作用兩方面, 正常狀態下其濃度維持相對恒定的水平, 對機體生理狀態變化和外界環境因子刺激非常敏感, 是重要的生理、病理和毒理學指標[11]。本研究中, 高溫(24℃和27℃)脅迫初期大菱鲆血糖含量快速升高, 于脅迫后3 h~6 h即達最高值, 其后則呈現逐漸下降趨勢, 而21℃實驗組則呈現不同的變化趨勢, 脅迫24 h內無顯著性變化, 48 h后顯著升高。這是由于溫度對魚類血糖的影響普遍認為, 在適溫范圍內, 溫度升高, 機體代謝旺盛, 血糖含量升高, 健康狀況良好; 當超過最適溫度, 實驗初期環境溫度急劇變化時, 機體表現出運動頻率增加、呼吸速率加快的行為變化, 亟需能量物質的供應, 應激脅迫刺激HPI軸釋放皮質醇進入循環系統, 促使肝糖原降解速率加快和糖異生作用增強, 血糖的升高滿足高溫導致機體能量代謝水平上升的需求, 而隨著脅迫時間延長, 血糖被消耗以供應能量, 肝糖原被大量分解, 導致血糖含量顯著降低[19,25]。同時, 48 h后熱應激組血漿血漿皮質醇含量呈現下降趨勢, 也暗示實驗魚可能處于應激后適應調整階段, 相關研究也表明魚類血糖與皮質醇之間存在相互調節機制, 皮質醇可以通過調節肝臟、腎臟組織相關酶活性的變化, 使糖異生反應受阻, 使得血糖水平進一步降低, 而高血糖癥狀又可以反饋調節血漿皮質醇的持續升高[29,30]。本實驗中大菱鲆血糖變化是否存在熱應激后適應調節機制, 則需要對熱應激過程中HPI軸組織血漿皮質醇合成酶、葡萄糖降解酶和異生酶等相關基因表達水平和酶活變化規律進行深入研究。溫度對魚類血糖含量的影響在多種魚類得到相似的結論[11,25,26], 血糖可以作為大菱鲆溫度急性脅迫的良好指標, 與血漿皮質醇指標的變化規律相似, 24℃和27℃熱應激組在脅迫初期(3 h~6 h)檢測血糖含量, 即可準確反映溫度應激狀態, 且血糖含量高低與脅迫溫度正相關, 21℃則需延遲至48 h后血糖含量才顯著升高。

溫度同樣影響魚類抗氧化能力, 水溫升高會提高魚類新陳代謝速率, 導致機體耗氧率的增加, 促使氧自由基(ROS)的產生, 從而導致氧化壓力, 引起機體抗氧化反應[31]。大量研究表明, 魚類暴露于溫度脅迫下其血清抗氧化酶活性常呈現增加的趨勢, 如暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)[6]和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)[32]等。本研究中, 高溫急性脅迫下, 大菱鲆血漿SOD酶活和GSH含量均在脅迫初期(0~6 h)呈現顯著的上升趨勢, 表現出抗氧化應激的生理狀態, 但脅迫6 h后, 血漿SOD酶活和GSH含量隨脅迫時間延長無顯著變化趨勢, 也未表現出與溫度梯度的相關性, 同一取樣時間各溫度組間無顯著性差異。Lu[16]等通過大菱鲆高溫敏感型家系和耐高溫家系的溫度脅迫實驗, 也證實耐高溫家系在溫度(25.5℃和29.5℃)脅迫初期(0 h和6 h)血清SOD酶活呈顯著上升趨勢, 而25.5℃組SOD酶活0、6、24 h間無顯著性差異, 與本研究結果相似, 高溫脅迫初期血漿SOD酶活上升, 而脅迫后期SOD酶活未表現出顯著性變化。究其原因, 可能與脅迫初期, 高溫導致的ROS快速積累, 亟需依賴血清抗氧化系統清除多余的自由基, 促使抗氧化酶活性增加, 而隨著脅迫的延長, 肝臟可能成為抗氧化酶促反應的主要場所, 正如低溫脅迫對云紋石斑魚肝臟和血清抗氧化指標影響的研究報道相似[33], 肝臟抗氧化酶活力增加, 血清抗氧化酶活力則無顯著性變化。高溫對大菱鲆氧化應激反應的影響仍需深入研究, 其血漿SOD酶活和GSH含量不能準確反應機體的氧化應激狀態。

堿性磷酸酶(AKP)是魚類重要的非特異性免疫標志酶, 存在于多種魚類組織, 具有防御和消化的雙重作用, 也是重要的代謝調控酶, 參與磷酸基團轉運和代謝、鈣磷調節等, 其含量受環境變化的影響, 反映了魚類應激狀態[34]。溫度脅迫對魚類血清AKP活性的影響研究相對較少, 對虹鱒[22]和銀鯧(Pampus argenteus)[35]的熱應激研究結果表明, 血清AKP活性隨溫度升高呈下降趨勢。本研究中, 脅迫初期(12 h內)高溫組血漿AKP活性不斷下降, 至12 h顯著低于對照組, 表明高溫急性脅迫初期, 機體調控代謝能力下降, 48 h后脅迫組AKP活性明顯上升, 顯著高于對照組, 且升高幅度與溫度呈正相關, 可能是由于大菱鲆重要代謝組織肝臟經急性溫度脅迫后產生損傷或出現障礙, 內源性AKP大量釋放經循環系統進入血液有關[34], 導致血漿AKP酶活短時間快速升高。

綜上所述, 在pH 7.85、鹽度29.5和溶解氧高于6.5 mg/L的環境條件下, 馴化溫度為18±1℃的大規格大菱鲆幼魚(平均體質量183.65 g±15.99 g), 采用1 /h℃ 的升溫速率, 96 h高起始致死溫度為28.05 ; ℃21℃組血漿皮質醇和GLU含量均隨脅迫時間延長呈相對升高的趨勢, 血漿皮質醇含量24 h~48 h達最高值, GLU含量則在48 h~72 h達最高值, AKP活性無顯著性變化, 伴隨機體運動頻率的增加, 表明21℃開始出現熱應激反應并進入適應性調節狀態; 24℃組脅迫初期(3 h~6 h)血漿皮質醇、GLU含量均顯著提升, 脅迫后期GLU迅速降低(48 h)、AKP活性快速上升(72 h), 表明24℃可能是大菱鲆熱應激由適應性調節進入受損狀態的“關鍵高溫點”, 伴隨少量個體出現死亡; 27℃組脅迫初期(3 h~9 h)血漿皮質醇、GLU含量、GSH含量、SOD活性均顯著性升高, 脅迫后期GLU顯著降低(24 h)、AKP顯著升高(48 h), 暗示肝臟等組織受損嚴重, 死亡比例近40%, 表明27℃是大菱鲆大規格商品魚養殖過程中高溫耐受上限; 血漿皮質醇、GLU和AKP含量/活性可以作為大菱鲆熱應激過程的敏感指標。