鹽場海芽孢桿菌與大洋鐵錳結核相互作用

呂 靖 , 藍 鑫, 姜明玉 曹文瑞 薩仁高娃 于心科 常鳳鳴

(1. 中國科學院海洋研究所 海洋地質與環境重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院海洋大科學研究中心, 山東 青島 266071; 3. 中國科學院大學, 北京 100049; 4. 哥倫比亞大學傅氏基金工程和應用科學學院, 美國 紐約 10027)

大洋鐵錳結核富含鐵、錳、銅、鈷和鎳等多種金屬元素, 是一種水下固體礦產資源, 廣泛分布在世界各大洋底部, 亦稱之為多金屬結核、錳團塊、錳礦球和錳瘤等[1]。鐵錳結核中的主要礦物是水羥錳礦和非晶態的水羥鐵礦, 鈷、鎳、銅等金屬元素主要賦存在錳氧化物中[2]。大洋鐵錳結核具有較高的經濟價值, 根據Mero估計鐵錳結核儲量約超過3萬億噸, 太平洋的克拉里昂和克里伯頓斷裂帶之間的區域是最具有開采價值的富礦區, 鐵錳結核遠景儲量達150億噸[3]。

對于鐵錳結核的成因, 至今仍未取得比較一致的看法。早期的觀念認為, 鐵錳結核是由氧化作用和膠體化學作用使Mn和Fe等元素從底層水和沉積物間隙水中積聚形成, 在最低含氧層下方, 先形成的鐵錳水合氧化物膠體從水中吸附鈷、鎳等微量金屬元素, 然后在基巖上不斷積累進而形成鐵錳結核。該機制得到了膠體化學的實驗證明, 同時還得到微量元素、稀土元素、結構構造以及微體化石的佐證[4]。鐵錳結核的物質成分是多源的, 可因成礦物質的來源劃分為上覆海水來源的水成型、沉積物間隙水來源的成巖型和海底熱液噴發物質來源的熱液型等成因類型[5]。有研究認為鐵錳結核的形成中起主導作用的應為生物源物質, 海洋中大量的微生物能夠促進許多化學變化與成巖作用, 而浮游生物是Cu、Ni、Co等微量元素的有效載體, 有利于鐵錳結核的生長和富集[6]。有孔蟲、放射蟲、硅藻等生物吸附海水中的金屬元素, 當這些有機體的殘骸下沉時也將這些元素帶到海底, 其體內吸附的多種金屬元素釋放出來, 對鐵錳結核形成能起到重要的作用。隨后一些學者認為微生物在鐵錳結核的形成過程中可能起著重要的作用, 因此大致形成了兩種觀點: 其一是微生物成因觀點, 即認為在微生物群的作用下形成了鐵錳結核; 其二是化學成因觀點, 認為是海底(局部)富多金屬的熱液或富多金屬的流體沉淀形成。還有一些學者提出了生物與生物-化學二元形成機制[7]。

近年來的研究趨勢開始重視微生物的生命活動在鐵錳結核形成中的作用, 微生物與礦物具有相輔相成的作用, 礦物能夠為微生物提供代謝活動所需的電子受體及能源、微營養, 微生物參與金屬元素的遷移、轉化、富集與成礦, 能通過生命代謝活動將巖石礦物中的重金屬富集成礦[8]。微生物對幾乎所有類型的巖石和礦物都有破壞分解作用, 可以通過產生有機酸、胞外多聚物、鐵載體等多種方式來溶蝕礦物, 進而釋放出K、Si、Fe和Mg等礦質元素[9], 例如Bacillus類細菌在生長過程中可以從長石等礦物中釋放出Na、K、Ca、Si等元素[10]。微生物的細胞壁能夠為礦物的沉淀提供成核位置[11], 本研究組前期的研究工作闡明了在較長時間的吸附過程中, 水溶液中溶解的金屬元素可以被吸附到微生物表面并富集形成金屬礦物[12-15]。微生物具備富集金屬元素并形成礦物的能力, 因此研究海洋微生物對鐵錳結核的作用對于了解鐵錳結核的生物成因極為重要。通過分析對比前期從多個不同區域海洋沉積物樣品中分離培養的微生物, 選取分離自東海大陸架沉積物的鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis)為試驗菌株。鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis)在海洋中廣泛存在且易于培養, 此種屬細菌在海洋沉積物樣品的微生物群落結構中所占比例較大。本文從該菌種入手, 考察普通的海洋細菌和鐵錳結核的相互作用效果, 研究海洋微生物對大洋鐵錳結核中Fe、Mn、Co、Ni、Cu元素的釋放以及對鐵錳結核礦物組成的影響, 以期為深入理解微生物與鐵錳結核相互作用過程及鐵錳結核生物成因等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis)由本研究組分離自東海大陸架沉積物的表層樣品(表層1 cm, 水深81.13 m), 菌株16s RNA 基因序列(GenBank No: KP307823)與其親緣菌株Marinibacillus campisalis strain C0010的16s RNA 基因序列(GenBank No: GU947875)相似性為99.2%。Marinibacillus campisalis是革蘭氏陽性桿菌, 大小約1.5~ 3.0 μm, 生長溫度在4℃~39℃[16]。將凍存于–80℃冰箱中的菌種接種到培養基中, 活化后搖床120 r/min、25℃培養1天。選用培養基組成為: 人工海水(24.32 g/L NaCl, 10.98 g/L MgCl2·6H2O, 4.06 g/L Na2SO4, 0.20 g/L NaHCO3, 0.027 g/L H3BO3, 0.10 g/L KBr, 0.69 g/L KCl, 1.14 g/L CaCl2)加入5 g/L蛋白胨, 1 g/L酵母提取物, pH調節至7.25。

實驗用鐵錳結核樣品大小約在3厘米左右, 外表呈黑色圓球狀、瘤狀, 剖面特點為外層黑色殼體包裹內部沉積物(圖1)。樣品于2014年“科學號”考察船采自西太平洋東菲律賓海, 水深約4 092 m。剝離鐵錳結核樣品外層黑色部分, 用瑪瑙研缽研磨, 選取65目的樣品粉末, 水洗后60℃烘干, 并在121℃下滅菌30 min備用。

考慮到對后續元素測定的影響, 反應體系采用人工海水(24.32 g/L NaCl, 10.98 g/L MgCl2·6H2O, 4.06 g/L Na2SO4, 0.20 g/L NaHCO3, 0.027 g/L H3BO3, 0.10 g/L KBr, 0.69 g/L KCl, 1.14 g/L CaCl2), pH調節至8.32。

圖1 鐵錳結核形貌 Fig. 1 Morphological features of the ferromanganese nodules

1.2 實驗方法

采用500 mL錐形瓶, 每瓶加入350 mL人工海水, 在121℃下滅菌30 min備用。離心管收集預先培養好的細菌(4 000 r/min離心10 min), 用滅菌后的0.1 mol/L NaCl溶液水洗3次后加入滅菌的人工海水中, 測定反應體系的菌密度, 加入菌液的設為有菌組, 同時未加入菌液的設為無菌組。隨后在無菌操作臺中向有菌組和無菌組中分別加入3 g事先處理好的鐵錳結核粉末, 在搖床120 r/min、25℃條件下培養21天。反應過程中在不同的時間點間隔取樣, 測定反應體系中離子濃度變化和pH值變化, 并觀察不同時間微生物表面礦物形成情況, 測定鐵錳結核和Marinibacillus campisalis相互作用21天后鐵錳結核礦物組成的變化。

1.3 測試方法

采用UV-5500PC型分光光度計測定Marinibacillus campisalis的OD600, 繪制生長曲線。通過X射線熒光光譜(X-ray Fluorescence, XRF)分析(德國布魯克公司SB Tiger波長型)測定鐵錳結核樣品的主要元素組成。

反應過程中在不同時間點間隔取樣, 用移液槍吸取液體, 離心后收集上清液, 通過0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾, 采用電感耦合等離子體發射光譜(Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer, ICP-OES, PerkinElmer公司, Optima 7300DV)和電感耦合等離子體質譜(Inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS, Thermo Fisher公司, ICAP- QC)測定反應體系中的Fe、Mn、Co、Ni、Cu等總離子濃度。對每個樣品進行了三次重復測定, Fe、Mn、Co、Ni、Cu離子濃度測定的相對標準偏差分別約為3%、1%、1%、2%、2%。由于Fe、Mn、Co、Ni、Cu是鐵錳結核外層殼體成分中最主要的幾種元素, 因此, 可以通過分析溶出離子濃度的變化, 探討Marinibacillus campisalis在大洋鐵錳結核形成或分解過程中的作用。

采用透射電鏡(Transmission Electron Microscope, TEM, Hitachi公司, HT7700)觀察未加入結核粉末時的菌體形態, 觀察加入結核粉末反應1天后和4天后微生物表面的礦物形成情況。取培養液4 000 r/min離心10min后去除上清液, 用超純水反復清洗菌液3遍后, 吸取少量菌液滴到銅網上, 待干燥后采用透射電鏡進行觀察。

采用掃描電鏡(Scanning Electron Microscope, SEM, Hitachi公司, S-4800型)觀察及能譜儀(Energy Dispersive Spectrometer, EDS)分析原始鐵錳結核粉末, 觀察并分析反應過程中微生物表面形成的礦物。取培養液4 000 r/min離心10min后去除上清液, 用超純水反復清洗菌液3遍后, 吸取少量菌液滴到硅片上, 于45℃烘干, 固定于電鏡樣品臺上, 噴金, 掃描電鏡進行觀察, 工作電壓15 kV。

大洋鐵錳結核和Marinibacillus campisalis相互作用21天后, 收集鐵錳結核礦物粉末(4 000 r/min離心10 min), 60℃烘干干燥后運用X射線衍射(X-ray Diffraction, XRD Bruker D-8)分析鐵錳結核的礦物組成。

2 結果與分析

2.1 鐵錳結核元素組成

鐵錳結核核心和殼層的元素含量差別較大, 核心中的Fe、Mn 、Co 、Ni、Cu含量較低, 主要成分為SiO2、Al2O3及少量的鈣鎂氧化物。而Fe、Mn、Co、Ni、Cu等金屬元素含量大約96%~98%分布在殼層中[1]。實驗用鐵錳結核全巖樣品與外層黑色樣品的元素組成見表1。鐵錳結核外層黑色部分Fe、Mn、Ti、Ni、Co、Pb、Ce等金屬元素含量較高, 大約是全巖樣品中含量的2倍, Na、K、Cl、S等元素含量比較低, 可以看出鐵錳結核外層黑色部分富集大量Fe、Mn等金屬元素, 因此選取鐵錳結核外層黑色樣品用于實驗。

2.2 鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis)生長曲線

由于細菌濃度與吸光度成正比, 因此可利用吸光度來測定菌液濃度, 繪制其生長曲線(圖2)。由圖2可知, Marinibacillus campisalis在12—24 h處于對數生長期, 此時細胞數迅速增長, 酶系活躍、代謝旺盛, 最適宜接種至反應體系。24 h后, 細菌逐步進入穩定期, 代謝產物累積, 生長速率逐漸降低。

2.3 pH值變化

pH值是培養液性質的重要指標之一。在120 r/min、25℃反應條件下, 通過不同時間點間隔取樣, 測定了實驗過程中有菌組和無菌組反應體系的pH值變化(圖3)。由圖3可以看出, 有菌組和無菌組反應體系的pH值均穩定在7.5~8.0且差別不大, 推測反應過程中沒有有機酸的釋放。在反應進行1天內, 兩種條件的pH值均有輕微程度的降低, 推測由于鐵錳結核溶出各種金屬離子, 金屬離子的水解作用導致反應體系pH值有一定程度降低。

表1 大洋鐵錳結核樣品的元素組成 (單位: ppm) Tab. 1 The elemental composition of the ferromanganese nodules

圖2 鹽場海芽孢桿菌生長曲線 Fig. 2 Growth curve of Marinibacillus campisalis

圖3 反應溶液pH值變化曲線 Fig. 3 Changes in pH value in the culture solution

2.4 主要離子濃度的變化

測試了Marinibacillus campisalis和鐵錳結核相互作用7天內, 有菌組以及無菌組中Fe、Mn、Co、Ni、Cu等元素總離子濃度變化。由圖4可以看出, 在Marinibacillus campisalis的作用下Fe、Mn、Ni、Cu元素的總離子濃度大于無菌組的濃度, 有菌組Fe、Mn、Ni元素的總離子濃度在1天內大幅增加后又降低, 2—7天內的離子濃度相較于1天內又有一定程度降低, 但仍高于無菌組的濃度。結合圖2中鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis)的生長曲線可知, 1天內是Marinibacillus campisalis的對數生長期, 此時細菌量迅速增加, 細菌活性較強, 可能對鐵錳結核中Fe、Mn、Ni等元素的釋放有一定程度促進作用; 2—7天內細菌處于穩定期, 對鐵錳結核元素的釋放能力有所減弱, 此外細菌又對反應體系中的金屬離子有富集作用, 能夠使金屬離子被吸附固定到細菌表面[12-15], 因而可能導致Fe、Mn、Ni總離子濃度在反應1天后有所降低, 但總體趨勢仍高于無菌組。在有菌組的反應體系中, Cu元素的總離子濃度高于無菌條件且呈現不斷增加的趨勢, 表明鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis)對結核中Cu元素的溶解釋放作用強于吸附固定作用。Co元素的總離子濃度在兩種條件下的差別不大, 表明鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis)促進Co元素釋放的作用較弱。

2.5 透射電鏡觀察

運用透射電鏡對鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis)的菌體形態進行觀察, 鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis)的大小約在1~2 μm, 呈橢 圓桿狀, 有鞭毛(圖5a, 5b)。對有菌組反應1天后和4天后進行取樣, 透射電鏡觀察微生物表面礦物形成情況的變化。圖5c、d是反應1天后不同位置觀察到的菌體形態, 與圖5 a、b對比可以看到, 正常培養的細菌表面沒有其他物質存在, 而加入鐵錳結核粉末反應1天后, 可以看到在細菌表面吸附聚集了很多非常微小的顆粒物質, 大小約0.1 μm, 并且有的顆粒物嵌入了細菌表面。圖5e、f是反應4天后不同位置觀察的菌體形態, 與圖5 c、d對比, 可以看到細菌表面嵌入的顆粒變大, 約0.5 μm, 并且沒有觀察到反應1天后觀察到的微小顆粒。在微生物表面觀察到的這些微小顆粒, 可能是由于細菌的細胞表面含有大量帶負電荷的官能團, 能夠吸附反應體系中的金屬陽離子, 從而在細胞表面形成含金屬離子的微小顆粒[12,14]。

圖4 反應溶液中Fe(a)、Mn(b)、Ni(c)、Cu(d)、Co(e)濃度變化 Fig. 4 Concentrations of Fe(a), Mn(b), Ni(c), Cu(d), and Co(e) in the culture solutions

2.6 掃描電鏡觀察及能譜分析

為了鑒定微生物表面顆粒物的成分, 運用掃描電鏡能譜(SEM-EDS)分析了粉末狀鐵錳結核的礦物元素組成, 并檢測了實驗過程中菌體表面顆粒物的元素組成, 與原始鐵錳結核礦物成分進行對比。圖6A、a分別是鐵錳結核礦物的SEM和EDS結果, 可以看到原始的鐵錳結核粉末形狀較規整, 顆粒較大, 在100 μm左右, 接近之前研磨過篩的尺寸, 元素組成較復雜, Fe、Mn含量較高, 約在20%左右, 并且含有Ti、Co、Ni、Cu等微量金屬元素。圖6B、b和圖6C、c是菌體表面顆粒物的SEM和EDS結果, 圖6B、b中顆粒物大小約在1 μm左右, 元素組成較簡單, Fe含量3.83%, 未測得Mn以及其他微量金屬元素。圖6C、c中顆粒物大小約在2 μm左右, 元素組成較簡單, Fe含量9.87%, Mn含量5.06%, 未測得其他微量金屬元素。微生物在溶解礦物的同時, 能夠誘導形成新的礦物[17], 微生物具有較大的比表面積和豐富的電荷[18], 能夠從周圍環境中吸附和富集金屬離子, 又可以利用其細胞壁作為礦物成核結晶的模板[19], 形成菌體-礦物復合體, 當細胞最終死亡時, 菌體的形態保持良好, 菌體便形成了新形成的礦物的核心[10]。由于菌體表面的顆粒物和原始的鐵錳結核礦物成分差別較大, 推測顆粒物是通過微生物成礦作用形成的, 反應過程中鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis)促進鐵錳結核溶解釋放出金屬離子, 隨后金屬離子又被吸附在菌體表面, 形成了簡單的含Fe化合物, 如圖6B、b所示; 隨著反應時間的增長, 細菌繼續吸附富集金屬離子, 顆粒物逐漸增大, 形成了新的礦物, Fe、Mn含量增加, 如圖6C、c所示。

圖5 微生物表面形態 Fig. 5 Morphology of the microbial surface

2.7 反應前后鐵錳結核礦物XRD分析

在Marinibacillus campisalis與鐵錳結核外層礦物相互作用21天后, 運用X射線衍射手段分析反應前后鐵錳結核礦物組成的變化。在中性或堿性條件下鐵離子能夠緩慢生成針鐵礦[20]。本實驗在中性偏堿性條件下進行, 由圖7可以看出, 剝離的鐵錳結核外層粉末經過Marinibacillus campisalis的作用, 菱鐵礦、赤鐵礦和針鐵礦等有輕微程度的增加。菱鐵礦(FeCO3)衍射特征主峰強度由34增加為57, 赤鐵礦(Fe2O3)衍射特征主峰強度由31增加為52, 針鐵礦(α-Fe2O3)衍射特征主峰強度由64增加為83。結合反應體系中總離子濃度變化和菌體表面形成的礦物結果, 通過Marinibacillus campisalis的成礦作用, 形成了新的含Fe化合物和含Fe、Mn的礦物顆粒, 因此在XRD結果中鐵礦物有輕微程度的增加。由于實驗選用的鐵錳結核樣品中鐵錳礦物初始含量較高, 而且反應體系中微生物量相對較少, 影響了微生物的作用效果, 因此可能導致了XRD結果中沒有體現出明顯的礦物含量變化。Marinibacillus campisalis同樣促進了Cu的釋放, 但是由于Marinibacillus campisalis對結核中Cu元素的溶解釋放作用強于吸附固定作用, 總離子濃度呈現不斷增加的趨勢, 在EDS和XRD結果中亦沒有體現出含銅礦物的變化。

圖6 微生物表面礦物SEM/EDS分析 Fig. 6 SEM and EDS analysis of microbial surface minerals

圖7 有菌組和無菌組礦物的XRD圖 Fig. 7 XRD patterns of minerals in blank and microbial action

3 討論

微生物能夠促進礦物的溶解或形成, 許多微生物通過催化或以其他方式控制礦物形成或溶解, 對礦物產生重大影響[21]。微生物能夠通過產生有機酸、胞外多聚物、鐵載體等方式來溶蝕礦物, 進而促進礦物中礦質元素的釋放[9]。此外, 微生物可以通過將金屬陽離子結合到細胞膜的帶負電基團上來促進金屬礦物在其細胞表面的積累, 結合的金屬離子隨后可以與陰離子反應以形成不溶性鹽, 在足量的陽離子和陰離子的情況下, 細胞表面的金屬鹽形成礦物, 陰離子可能是細菌代謝的產物, 也可能具有非生物起源。當細胞最終死亡時, 菌體便形成了新形成的礦物的核心[10]。已有大量微生物誘導形成鐵礦物或錳礦物的研究將海洋錳結核的起源與細菌活動聯系起來, 認為錳氧化細菌能夠參與海洋錳結核的形成, 而且在海洋錳元素的循環中起著舉足輕重的作用[22-24]。錳氧化菌參與海洋錳結核的形成有三類方式[10]: 一類通過將氧化錳與細胞表面結合, 然后通過細胞聚集引發結核形成; 一類通過將海水中游離態的錳離子與細胞表面結合并氧化形成結核[25]; 一類通過對錳鐵氧化物或某些黏土礦物中的錳進行氧化, 這類錳氧化菌能夠從氧化過程中獲得能量。這種作用機制直接解釋了錳氧化菌影響結核生長。已有較多與微生物誘導錳礦化相關的研究成果, 如芽孢桿菌屬細菌能夠促進菱錳礦的形成和沉淀[26]。此外有些微生物能夠將弱結晶的鐵氧化物還原為離子態Fe(II)或者含Fe(II)礦物, 已報道的有磁鐵礦、菱鐵礦等[27-29], 微生物可直接或者間接地參與自然界含Fe礦物的遷移、富集、轉化和沉淀, 并直接影響生物地球化學循環[30-31]。有研究認為微生物對大洋沉積物中鐵、錳的轉移及沉析起極大作用, 遠大于單純的化學沉積作用, 能夠加速鐵錳結核的形成[32]。通過相互作用過程中反應體系的pH值變化、總離子濃度變化、微生物表面礦物形成情況變化以及反應前后的鐵錳結核礦物組成多方面的綜合分析, 鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis)能夠促進鐵錳結核中Fe、Mn、Cu等元素的釋放, 對Cu元素的吸附固定作用較弱, 沒有新形成的含銅礦物, 但是能夠對Fe、Mn產生富集作用, 吸附金屬離子到細菌表面, 從而在細胞表面形成簡單的含Fe化合物和含Fe、Mn的礦物顆粒, 最終鐵錳結核粉末中的菱鐵礦、赤鐵礦和針鐵礦等有輕微程度的增加。因此推測在海洋微生物的作用下, 如此次實驗選用的鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis), 能夠促進鐵錳等元素的成礦, 在較長時間的相互作用過程中, 海水中的金屬離子能夠在海洋微生物的作用下被吸附固定形成金屬礦物, 進而可能對大洋鐵錳結核的形成有一定程度的促進作用。

4 結論

本文詳細研究了鹽場海芽孢桿菌(Marinibacillus campisalis)與大洋鐵錳結核粉末狀樣品的相互作用過程, 分析了海洋微生物對大洋鐵錳結核礦物組成及其主要金屬元素遷移過程的影響, 初步探究了可能存在的海洋微生物誘導礦化機制。表明海洋微生物對大洋鐵錳結核中鐵錳元素的成礦有重要作用, 海洋微生物的誘導成礦可能能夠促進大洋鐵錳結核的形成。