ARMCX1對宮頸癌SiHa細胞增殖和凋亡的影響*

肖 莉，高 月，馬秀潔，孫雪竹，李亞娟，曹芳蕾，范 雪

(1 錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科， 遼寧 錦州 121001； 2重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院檢驗科， 重慶 400700)

含Armadillo重復序列X連鎖蛋白1(Armadillo repeat-containing X-linked protein 1, ARMCX1)是ARM蛋白家族的成員之一。研究顯示在人類多種正常組織中ARMCX1的mRNA水平表達增高而在腫瘤組織和腫瘤細胞株中卻低表達[1]。研究也證實ARMCX1蛋白水平在乳腺癌組織中低表達，而在正常乳腺組織中高表達[2-4]。曾帆等[5-6]的研究卻發(fā)現(xiàn)ARMCX1蛋白水平在宮頸癌組織中高表達而在正常宮頸組織中低表達。ARMCX1在不同的腫瘤中蛋白水平表達不同，在不同的腫瘤中很可能發(fā)揮著不同的作用。因此，我們猜測ARMCX1在宮頸癌中很可能作為一種癌基因發(fā)揮重要作用。我們以宮頸癌細胞SiHa為研究對象，探討ARMCX1對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響，為深入研究ARMCX1在宮頸癌發(fā)病機制中的作用提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人宮頸癌SiHa細胞購自ATCC。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Invitrogen；鼠抗人細胞周期蛋白E(cyclin E)、細胞分裂周期蛋白25A (cell division cycle 25A,Cdc25A)、Bcl-2、Bax和ARMCX1單克隆抗體及兔抗人β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz；抗active caspase-3抗體購自Abways；siRNA由上海吉瑪公司合成。3條沉默ARMCX1的siRNAs和對照序列(RNAi-Con)如下：RNAi-1為5′-CCUGGAGCGAACAAAUGAUTT-3′(正義鏈)和5′-AUCAUUUGUUCGCUCCAGGTT-3′(反義鏈)；RNAi-2為5′-GCCUGCUACUGUGUAUACATT-3′(正義鏈)和5′-UGUAUACACAGUAGCAGGCTT-3′(反義鏈)；RNAi-3為5′-GCUGGGCUAAGACUGUUAATT-3′(正義鏈)和5′-UUAACAGUCUUAGCCCAGCTT-3′(反義鏈)；RNAi-Con為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ (正義鏈)和 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (反義鏈)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) SiHa細胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，放置于5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融匯至70%～80%，生長良好用于實驗。

2.2小干擾RNA轉染SiHa細胞 將SiHa細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按每孔1×105個細胞加入6孔板，待密度約50%，按Lipofectamine 2000說明書轉染細胞48～72 h。細胞分為對照(RNAi-Con)組和實驗(RNAi-1、RNAi-2和RNAi-3)組，利用real-time PCR和Western blot檢測ARMCX1的表達水平，以確定其中一條沉默效果好的siRNA進行后續(xù)實驗。

2.3細胞轉染 轉染前將SiHa細胞制成懸液，接種于6孔板中。在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融匯至50%～60%時，加入8 μL的siRNA溶液和4 μL Lipofectamine 2000，再加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基到2 mL培養(yǎng)48 h。實驗共分為NC-control組和siRNA-ARMCX1組。

2.4平板集落形成實驗 將轉染后的SiHa細胞制成細胞懸液(1×106個/L)，以每孔500個的濃度加入12孔板，輕輕混勻，隔2 d換次培養(yǎng)液。孵育10 d，PBS緩沖液清洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS緩沖液清洗3次，用0.2%結晶紫染色液染色10 min，計數(shù)集落數(shù)目，上述實驗重復3次。

2.5流式細胞術檢測細胞周期分布 siRNA轉染SiHa細胞48 h后，胰酶消化后離心，收集細胞，PBS緩沖液沖洗2遍，離心棄上清，緩慢加入體積分數(shù)75%的冷乙醇2 mL固定，4 ℃過夜；細胞密度調整為5×108～1×109個/L，PBS緩沖液重懸后加碘化丙啶(propidium iodide, PI)染液1 mL，避光15 min，流式細胞術檢測分析各組細胞的DNA含量，上述實驗重復3次。

2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 siRNA轉染SiHa細胞48 h后，胰酶消化后離心，收集細胞，PBS緩沖液沖洗2次，離心棄上清，再加入1 mL PBS混勻，再加入5 μL annexin V-FITC，振蕩混勻，4 ℃孵育15 min加入5 μL PI，孵育5 min，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，上述實驗重復3次。

2.7Western blot 檢測各細胞周期和凋亡相關蛋白的水平 收集轉染siRNA 48 h后的SiHa細胞。提取總蛋白，測定蛋白濃度。用8% SDS-PAGE進行分離后，將目的蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加 I 抗體4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5次，加入 II 抗室溫再孵育2 h，ECL化學發(fā)光，檢測蛋白表達水平。以β-actin作為內參照，各組蛋白表達水平=各目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，利用t檢驗統(tǒng)計分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 RNAi效率的檢測

將RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3及RNAi-Con序列分別轉染SiHa細胞，48 h后收集細胞,real-time PCR檢測ARMCX1的mRNA表達量，72 h后收集細胞用Western blot檢測ARMCX1蛋白的表達量。結果顯示RNAi-3序列沉默ARMCX1效果明顯(P<0.01)，用于后續(xù)實驗，見圖1。將RNAi-3命名為siRNA-ARMCX1，對照組命名為NC-control。

Figure 1. The silencing ofARMCX1in SiHa cells transfected with siRNAs. A: the mRNA expression of ARMCX1 detected by real-time PCR; B: the protein expression of ARMCX1 detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRNAi-Con group.
圖1 小干擾RNA轉染SiHa細胞后ARMCX1的表達

2 siRNA轉染后SiHa細胞集落形成能力的改變

利用平板集落形成實驗觀察敲減ARMCX1表達對SiHa細胞集落形成能力的影響，結果顯示實驗組SiHa細胞的集落形成數(shù)目明顯少于對照組(P<0.05)，見圖2。

3 siRNA轉染后SiHa細胞周期分布的變化情況

敲減ARMCX1表達的SiHa細胞其細胞周期被阻滯在S期，見圖3。

4 siRNA轉染后SiHa細胞凋亡變化情況

敲減ARMCX1表達的SiHa細胞其凋亡細胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)，見圖4。

5 siRNA轉染對SiHa細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

敲減ARMCX1表達的SiHa細胞中cyclin E和磷酸化Cdc25A的蛋白水平降低,Bcl-2蛋白表達量顯著減少，active caspase-3的蛋白水平顯著增加(P<0.05),見圖5。

討 論

ARM家族蛋白是一類含有Armadillo重復序列結構的蛋白。Armadillo重復序列結構首次在果蠅極性基因中發(fā)現(xiàn)，對果蠅胚胎和早期細胞極性形成以及維持上皮組織完整性具有重要作用[7]。ARMCX1蛋白是ARM蛋白家族的成員。生物信息學提示,ARMCX1基因位于Xq21.33-q22.2，其蛋白被一個外顯子編碼而且具有2個Armadillo重復序列結構[1, 8-9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在心臟、結腸、前列腺、腦和卵巢等大多數(shù)正常組織中ARMCX1表達呈高水平而在胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌組織中低表達，在肺癌、結腸癌和前列腺癌組織中沒有表達[1-3, 10-11]。但也有文獻發(fā)現(xiàn)ARMCX1在宮頸癌組織中高表達而在正常宮頸組織中低表達[5-6]。與之前的學者研究發(fā)現(xiàn)有所不同。我們猜測ARMCX1在宮頸癌中可能作為一種癌基因發(fā)揮重要作用。因此，我們以宮頸癌細胞SiHa為研究對象，探討ARMCX1對宮頸癌細胞增殖和凋亡方面的作用機制，為深入研究ARMCX1在宮頸癌發(fā)病機制中的作用提供依據(jù)。

Figure 2. The effect ofARMCX1expression knock-down on colony formation of SiHa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-control group.
圖2 敲減ARMCX1的表達對SiHa細胞平板集落形成能力的影響

Figure 3. The effect ofARMCX1expression knock-down on the cell cycle distribution of SiHa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-control group.
圖3 敲減ARMCX1的表達對SiHa細胞周期的影響

Figure 4. The effect ofARMCX1expression knock-down on the apoptosis of SiHa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-control group.
圖4 敲減ARMCX1的表達對SiHa細胞凋亡的影響

Figure 5. The effect ofARMCX1expression knock-down on the protein levels of apoptosis- and cell cycle-related molecules. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-control group.
圖5 敲減ARMCX1的表達對SiHa細胞增殖和凋亡相關蛋白水平的影響

已有文獻報道，在宮頸癌HeLa細胞中沉默ARMCX1能夠抑制宮頸癌細胞的生長，并且細胞周期阻滯在S期[5]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)在宮頸癌SiHa細胞中敲減ARMCX1的表達后，細胞的集落形成能力受抑制，并且S期細胞明顯增多，表明敲減ARMCX1的表達阻滯了SiHa細胞周期進程。cyclin/cyclin依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)是調控細胞周期進程的關鍵大分子，而cyclin E/CDK2是G1/S關鍵點重要的效應子。在G1/S轉化進程中，Cdc25A通過對cyclin E/CDK2的作用促進細胞進入S期，而Cdc25A 表達水平的下降導致細胞周期阻滯在S期[12]。我們的研究發(fā)現(xiàn)敲減ARMCX1的表達后，cyclin E和Cdc25A蛋白質表達水平均降低。因此我們猜測敲減ARMCX1的表達很可能直接或間接降低Cdc25A蛋白表達量，進而使細胞周期阻滯在S期。細胞周期被阻滯能夠抑制細胞的增殖，最終誘發(fā)細胞凋亡。caspase-3是caspase家族的重要成員，在細胞凋亡程序中起最后的樞紐作用[13]，active caspase-3是caspase-3的主要活化形式，具有生物學活性，active caspase-3的表達量可反映細胞凋亡情況。Bcl-2是caspase-3的上游調控蛋白，可抑制active caspase-3的表達，進而抑制細胞的凋亡。而Bax的作用正好相反，它具有促進細胞凋亡的功能[14-18]。本研究結果顯示，敲減ARMCX1的表達后凋亡的SiHa細胞數(shù)量增加，Bcl-2蛋白表達量減少，而Bax和active caspase-3蛋白量卻增加，提示敲減ARMCX1的表達很可能通過增加Bax和active caspase-3 的蛋白表達，降低Bcl-2的蛋白表達，進而抑制細胞增殖，誘導其凋亡。

綜上所述，本研究證明在宮頸癌細胞中敲減ARMCX1的表達能夠阻滯細胞周期，抑制細胞增殖，進而誘導細胞凋亡，其機制可能與沉默ARMCX1后引起細周期S期的相關蛋白cyclin E和Cdc25A蛋白表達量降低，細胞阻滯在S期，進而抑制細胞增殖。同時，引起B(yǎng)ax和active caspase-3的蛋白量的增加，降低了Bcl-2的蛋白表達，啟動內源性凋亡通路引起細胞凋亡。本研究的發(fā)現(xiàn)為進一步研究ARMCX1在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制提供了依據(jù)。