右歸丸對膝骨關節炎模型鼠軟骨組織顯微結構及熱休克蛋白90α蛋白表達的影響*

安方玉，顏春魯△，劉永琦，王繼龍，趙 磊， 夏鵬飛，駱亞莉，王國文，趙崇博，鄧 婕

[1甘肅中醫藥大學, 2甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究重點實驗室, 3甘肅省高校中(藏)藥化學與質量研究省級重點實驗室, 4敦煌醫學與轉化教育部重點實驗室， 甘肅 蘭州 730000]

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以膝骨關節軟骨退化損傷、關節邊緣和軟骨下骨反應性增生為特征的慢性關節炎疾病[1]，在疾病的活動期成為中老年人群發生疼痛和致殘的主要原因。目前治療KOA的首選藥物主要是鎮痛藥:非甾體抗炎藥和皮質類固醇類藥物。非甾體抗炎藥和皮質類固醇類藥物雖然起效快，但是長期服用非甾體抗炎藥和皮質類固醇類藥物只能緩解癥狀，并不能阻止關節軟骨破壞的進展，并且不良反應較大，為此，尋找安全、低毒、有效的藥物成為防治KOA的關注焦點。中醫認為，KOA屬于 “痹證”和“痿證”，肝腎虧虛、長期勞損及外感風寒濕邪是其主要病機。右歸丸(Youguiwan,YGW)具有溫補腎陽和填精止遺的功效，針對KOA的肝腎虧虛之癥，本方對KOA可能具有療效。本實驗通過復制膝骨性關節炎實驗性動物模型，以中藥右歸丸灌胃，觀察其對模型鼠膝骨性關節炎關節軟骨的病理及熱休克蛋白90α(heat shock protein 90α，Hsp90α)、纖連蛋白(fibronectin，Fn)蛋白和Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ，COL-Ⅱ)等相關蛋白表達的影響，分析中醫藥防治KOA的機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體重(180±20) g，購自我校科研實驗動物飼養中心。動物質量合格證號為SYXK(甘)2015-0005。

2 主要試劑

水合氯醛(天津市光復精細化工研究所，批號：20150105)；反轉錄試劑2×Prime Script RT Master Mix(大連寶生物工程有限公司，批號： AI20775A)； 熒光定量SYBR Premix EX TaqⅡ(Promega，批號為：0000304040)。β-actin、白細胞介素1β (interleukin-1β,IL-1β)、基質金屬蛋白酶3 (matrix metalloprotei-nase-3, MMP-3)和MMP-13的RT-qPCR引物序列由TaKaRa設計并合成。β-actin的上游引物序列為5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物序列為5’-GACTCATCGTACTCCGCTTGCTG-3’，擴增產物150 bp； IL-1β的上游引物序列為5’-CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA-3’，下游引物序列為5’-CCCAAGTCAAGGGCTTGGAA-3’，擴增產物為111 bp；MMP-3的上游引物序列為5’-TGATGGGCCTGGAATGGTC-3’，下游引物序列為5’-TTCATGAGCAG CAACCAGGAATAG-3’，擴增產物為136 bp；MMP-13的上游引物序列為5’-TGATGATGAAACCTGGACAAGCA-3’，下游引物序列為5’-GAACGTCATCATCTGGGAGCA-3’，擴增產物為173 bp。抗GAPDH抗體(ImmunoWay，批號：B4501)； rabbit anti-COL-Ⅱ polyclonal antibody(Gene Tex，批號：821801317)； rabbit anti-Hsp90α polyclonal antibody(Gene Tex，批號：821801325)； rabbit anti-Fn polyclonal antibody(Gene Tex，批號：821801378)。

3 主要儀器

BioMATE 3S型蛋白和核酸濃度測定儀(Thermo)； BX53型顯微鏡(OLYMPUS)；C1000型PCR熱循環儀(ABI)；LightCycler 96型 Real-Time PCR System(Roche)；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像分析系統(Bio-Rad)；TGL16M型臺式高速冷凍離心機(凱達集團成員高科技公司)；OSE-Y10型電動組織研磨器(Tiangen)。

4 實驗藥物及給藥劑量

右歸丸購自仲景宛西制藥股份有限公司(國藥準字Z41022170，批號：151108)，人的臨床用量為27 g/d，按照人與大鼠的體表面積換算法，27 g×0.018×5≈2.4 g/kg，作為中劑量，則右歸丸高、中、低劑量分別為4.8、2.4和1.2 g/kg；硫酸氨基葡萄糖(glucosamine sulfate， GS)片(保節力，新興同仁藥業有限公司，國藥準字H20041317，批號：160302)；青霉素(北制藥股份有限公司，國藥準字H13020657，批號：F6042103)。

5 實驗方法

5.1動物分組、造模及給藥 60 只 SD 大鼠適應性飼養 1 周后，隨機分為6組，分別為假手術對照(sham control,SC)組、模型(model,M)組、GS組及右歸丸高劑量(YGW-H)組、右歸丸中劑量(YGW-M)組和右歸丸低劑量(YGW-L)組，每組10只。參照文獻[2-3]，首先用4%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉各組動物，模型組及干預組采用改良Hulth 法復制KOA模型，假手術組 SD 大鼠從膝關節內側只打開關節腔，不破壞韌帶和半月板，并保留關節軟骨面。術后連續 3 d每天肌肉注射青霉素2×105U，各組大鼠均在相同條件下，自由飲水，攝食。手術造模 6 周后通過HE染色觀察軟骨細胞的形態變化以判定模型的是否成功，造模成功后給予藥物干預，硫酸氨基葡萄糖組灌服硫酸氨基葡萄糖(0. 17 g/kg)，右歸丸高、中、低劑量組分別按 4.8、2.4和1.2 g/kg灌服相應的藥物，干預 8周。用4%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉各組動物后股動脈采血處死各組動物，摘取雙側膝關節，左側膝關節固定于4%多聚甲醛，右側膝關節于-80 ℃冰箱保存備用。

5.2HE染色觀察骨形態學變化 動物處死后取完整膝關節，對左側膝關節脫鈣處理并脫蠟至水，采用石蠟包埋法制作蠟塊，并用切片機切片，切片厚度約5 μm，HE染色，封片、鏡檢并進行 Mankin 評分，具體評分標準參考文獻[4]進行。評分標準為：軟骨結構如常，軟骨細胞數量如常，基質染色正常，潮線比較完整記為0分；軟骨表面有不規則裂隙，軟骨細胞數量彌漫性增多，基質染色減退，出現多重潮線記為1分；軟骨裂隙深達肌層，軟骨細胞成簇生長，基質染色明顯減退，軟骨下血管浸入肌層記為2分；軟骨裂隙深達輻射層，軟骨細胞數量明顯減少，基質染色明顯減退記為3分；軟骨裂隙深達鈣化層，基質染色完全消失記為4分；軟骨層脫落記為5分。

5.3免疫組化法觀察軟骨組織Hsp90α、Fn和COL-Ⅱ的蛋白表達 4%多聚甲醛固定膝關節軟骨并脫鈣，將石蠟切片進行脫蠟、脫水后將切片放入配制好的枸櫞酸緩沖液盒中進行微波修復；3%H2O2室溫孵育30 min； 5%山羊血清封閉 30 min；滴加50 μL 的Hsp90α、Fn和COL-Ⅱ polyclonal antibody(這些I抗的稀釋比例分別為1 ∶100、1 ∶100和1 ∶300)，同時用PBS 緩沖液代替I抗設立陰性對照，將切片放入濕盒中，4 ℃過夜；滴加山羊抗兔的 II 抗，室溫下放置30 min；滴加ABC工作液，37 ℃孵育60 min；DAB顯色；蘇木精復染；二甲苯透明，封固。染色以軟骨基質表層和中層的軟骨細胞胞漿出現棕黃色顆粒為陽性染色，由我校病理教研室老師采用雙盲法進行閱片。應用 Image-Pro Plus 6.0 全自動圖像分析系統對軟骨細胞陽性染色的積分吸光度(integral absorbance,IA) 進行定量分析，對進行標記，以其中一個具有代表意義陽性結果的視野的棕黃色顆粒為標準,自動檢測所有視野的陽性結果[4]。

5.4軟骨組織IL-1β、MMP-3和MMP-13的mRNA表達測定 用 RNA抽提試劑提取軟骨組織RNA，BioMATE 3S型蛋白、核酸濃度測定儀測定 RNA 含量。用Promega 試劑盒說明書步驟合成 cDNA第1鏈，按Promega實時熒光定量試劑盒操作說明書進行PCR。反應條件為：預變性 95 ℃ 2 min；變性 95 ℃ 15 s、退火 58 ℃ 45 s、延伸 60 ℃ 1 min，共45個循環。每個樣品各重復 3 次，數據經 2-ΔΔCt處理后進行IL-1β、MMP-3和MMP-13的mRNA相對表達量分析。

5.5Western blot法測定軟骨組織Hsp90α和COL-Ⅱ的蛋白表達 軟骨組織蛋白質的提取用 RIPA 裂解液，蛋白質含量的測定用BCA 法，并調整點樣的蛋白質濃度為5 g/L，每孔10 μL，進行SDS-PAGE，轉膜，封閉，滴加抗rabbit anti-Hsp90α polyclonal antibody和rabbit anti-COL-Ⅱ polyclonal antibody等 I 抗孵育，滴加山羊抗兔IgG II抗孵育。采用 ECL Plus 超敏發光液染色觀察，將溶液A 和 B 等體積混勻后，按約0.125 mL/cm2膜面積進行染色，室溫反應1 min后置于 Image Lab 3.0 進行曝光，曝光條件為：單個曝光時間10 s，總曝光時間60 s。

6 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件分析，實驗數據結果用均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析(one-way-ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 膝關節軟骨組織的形態學觀察

HE染色結果顯示，假手術組大鼠關節面及滑膜結構完整，軟骨細胞呈水平排列，關節軟骨邊緣光滑；模型組大鼠關節軟骨邊緣嚴重破壞，軟骨細胞排列紊亂；右歸丸低、中劑量組關節軟骨邊緣不平整，軟骨細胞排列紊亂； 右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠軟骨結構趨于正常，軟骨細胞分布偶見不均，關節軟骨表面欠光滑,見圖1。Mankin評分結果顯示，與假手術組比較，模型組及各干預組大鼠Mankin評分均升高(P<0.01)；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠Mankin評分均降低(P<0.05或P<0.01),見圖2。

Figure 1. The pathomorphological changes of cartilages in each group (HE staining, ×200). A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
圖1 各組大鼠軟骨組織病理形態學變化

Figure 2. Comparison of Makin scores in each group. Mean±SD.n=6.##P<0.01vsSC group;*P<0.05,**P<0.01vsM group.
圖2 各組大鼠Makin評分結果的比較

2 軟骨組織Hsp90α、Fn和COL-Ⅱ蛋白表達的變化

染色以軟骨基質表層和中層的軟骨細胞胞漿出現棕黃色顆粒為陽性染色。假手術組 Hsp90α呈弱陽性表達，Fn和COL-Ⅱ均呈陽性表達；模型組關節軟骨中 Hsp90α強陽性表達，Fn和COL-Ⅱ均呈弱陽性表達；右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組Hsp90α弱陽性表達、Fn強陽性表達，右歸丸中、高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組COL-Ⅱ呈強陽性表達。與假手術組比較，模型組大鼠Fn和COL-Ⅱ蛋白表達明顯降低，Hsp90α蛋白表達明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組Hsp90α蛋白表達明顯降低、Fn蛋白表達明顯升高，而右歸丸中、高劑量組和氨基葡萄糖組COL-Ⅱ蛋白表達均明顯升高(P<0.01),見圖3～5和表1。

Figure 3. The cells with positive expression of Hsp90α protein in each group (IHC, ×200). A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
圖3 各組大鼠Hsp90α蛋白的陽性細胞表達結果

Figure 4. The cells with positive expression of Fn protein in each group (IHC, ×200). A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
圖4 各組大鼠Fn蛋白的陽性細胞表達結果

Figure 5. The cells with positive expression of COL-Ⅱprotein in each group (IHC, ×200). A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
圖5 各組大鼠COL-Ⅱ蛋白的陽性細胞表達結果

表1 各組大鼠Hsp90α、Fn和COL-Ⅱ蛋白免疫組織化學染色陽性表達IA值的結果比較
Table 1.IAvalues for the protein expression of Hsp90α, Fn and COL-Ⅱin each group (Mean±SD.n=6)

GroupHsp90αFnCOL-ⅡSC56×103174×103 35×103 M203×103##41×103##17×103##GS71×103??135×103??39×103??YGW-H54×103??151×103??44×103??YGW-M189×103 61×103 36×103??YGW-L193×103 52×103 18×103

##P<0.01vsSC group;**P<0.01vsM group.

3 軟骨組織IL-1β、MMP-3和MMP-13 mRNA表達的變化

與假手術組比較，模型組大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-3和MMP-13的mRNA表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，右歸丸各干預組和硫酸氨基葡萄糖組IL-1β、MMP-3和MMP-13的mRNA表達均顯著降低(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠IL-1β、MMP-3和MMP-13 mRNA表達的比較
Table 2. The mRNA expression of IL-1β, MMP-3 and MMP-13 in each group (Mean±SD.n=6)

GroupIL-1βMMP-3MMP-13SC1.00±0.091.00±0.091.00±0.03M7.50±0.23##5.57±0.04##6.18±0.01##GS3.86±0.11??1.27±0.08??2.74±0.06??YGW-H2.56±0.35??1.12±0.10??2.53±0.06??YGW-M4.71±0.15??2.44±0.03??3.18±0.04??YGW-L5.32±0.49??3.62±0.04??4.03±0.09??

##P<0.01vsSC group;**P<0.01vsM group.

4 軟骨組織Hsp90α和COL-Ⅱ蛋白表達的變化

與假手術組比較，模型組大鼠軟骨組織COL-Ⅱ蛋白表達明顯降低，Hsp90α的蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，右歸丸高劑量干預組和硫酸氨基葡萄糖干預組Hsp90α的蛋白表達顯著降低，右歸丸中、高劑量干預組和硫酸氨基葡萄糖干預組COL-Ⅱ蛋白表達明顯升高(P<0.05),見圖6和表3。

Figure 6. Protein expression of Hsp90α and COL-Ⅱ in cartilaginous tissues of each group. A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
圖6 各組大鼠軟骨組織Hsp90α和COL-Ⅱ蛋白的表達

表3 各組大鼠Hsp90α和COL-Ⅱ蛋白表達的結果的比較
Table 3. The protein expression of Hsp90α and COL-Ⅱ in each group (Mean±SD.n=6)

GroupHsp90αCOL-ⅡSC0.48±0.011.26±0.04M1.01±0.03##0.41±0.05##GS0.58±0.01?0.73±0.02?YGW-H0.63±0.03?0.63±0.05?YGW-M0.92±0.010.59±0.02?YGW-L0.75±0.020.38±0.02

##P<0.01vsSC group;*P<0.05vsM group.

討 論

KOA是一種累及膝關節軟骨組織、以疼痛和骨關節退變為主要病理特點的慢性進展性疾病。KOA在祖國醫學中屬于“骨痹”范疇，主要病機為本虛標實、本痿標痹；因肝藏血，血養筋，故肝之合筋也；腎主貯藏精氣，骨髓生于精氣，故腎之合骨也。中年以后肝腎虧虛，肝虛則血不養筋，腎虛則髓減，精血不足，筋骨失養，腠理空虛，易感風寒濕之邪而為痹；中醫治療多以補益肝腎為主要法則[5]。來自《景岳全書》的補腎方藥右歸丸，主要由“熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥、附子、肉桂、鹿角膠、菟絲子、杜仲、當歸”組成，方中附子、肉桂、鹿角膠培補腎中元陽，溫里祛寒，為君藥。熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥滋陰益腎，養肝補脾，填精補髓，取“陰中求陽”之義，為臣藥。再用菟絲子、杜仲補肝腎，強腰膝，配以當歸養血和血，共補肝腎精血，為佐藥。諸藥合用，以溫腎陽為主而陰陽兼顧，肝脾腎并補，妙在陰中求陽，使元陽得以歸原。相關研究發現，補腎活血中藥可顯著減輕KOA大鼠膝關節腫脹，改善軟骨形態，延緩軟骨退變，提示補腎活血中藥治療 KOA 可能具有緩解癥狀和修復結構的效果[6]。

本課題組前期研究發現，右歸丸能消除 KOA 模型大鼠膝關節腫脹，可有效延緩KOA模型大鼠的關節軟骨退變，其作用機制可能與降低血清 IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子水平，降低Wnt信號通路的WISP1、Wnt1、β-catenin和LRP5蛋白表達，以及升高DKK1的蛋白表達有關[7-8]。本研究通過觀察右歸丸對KOA模型組大鼠軟骨病理的影響，結果發現低、中、高劑量右歸丸均能減輕KAO模型組大鼠軟骨結構破壞的范圍和嚴重程度，改善軟骨細胞的形態結構并具有延緩關節軟骨退變的作用。Mankin評分進一步說明低、中、高劑量右歸丸可減輕KOA模型組大鼠的軟骨損傷，證實了右歸丸延緩軟骨退變、保護軟骨的作用，并呈現劑量依賴性，尤以右歸丸高劑量組作用最為明顯，其可能機制是右歸丸通過其方中的附子、肉桂、鹿角膠、熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥、菟絲子、杜仲等藥達到滋陰益腎、養肝補脾、填精補髓等功效，從而恢復肝腎對膝關節的濡養作用，有效改善KOA模型大鼠關節軟骨形態，達到延緩關節軟骨退變的目的。

Hsp90可以加重KOA機體的關節軟骨退化，在促進其機體關節軟骨細胞釋放NO中可能發揮重要的作用[9-10]。Hsp90是熱休克蛋白家族的成員之一，主要有Hsp90α和Hsp90β 兩種亞型，其功能的發揮可能是通過PI3K/Akt、IKK和NF-κB等信號通路完成的[11-12]。在骨關節炎中，軟骨細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的合成和降解之間的動態平衡被打破，其中以降解占主導地位。Fn屬于ECM的非膠原糖蛋白成分。膠原蛋白和彈性蛋白等結構蛋白可以通過纖連蛋白、層粘連蛋白以及其它的連接分子直接或間接與細胞表面受體結合而發揮調節細胞存活、分化、形態、遷移、組織穩態的建立與維持等生理功能[13]。Tao 等[14]研究發現，Fn可以與整合素α5β1受體相互作用增強軟骨修復。還有研究發現，COL-Ⅱ合成減少和降解加速與KOA的發生發展呈正相關，IL-1β 可抑制COL-Ⅱ蛋白的合成，使軟骨細胞變性，抑制軟骨細胞增殖和合成前列腺素，同時MMP-1和MMP-13的分泌可以裂解ECM中的COL-Ⅱ蛋白，破壞其形成的網架結構，促進軟骨基質的降解，導致軟骨發生破壞和缺損[15-19]。本實驗結果也發現，低、中、高劑量右歸丸均能減少模型組大鼠炎癥因子IL-1β及基質金屬蛋白酶MMP-1和MMP-13的分泌，同時降低了模型組大鼠Hsp90α表達，增強了模型組大鼠COL-Ⅱ和Fn的蛋白表達。這一結果說明右歸丸可能通過其方藥中的當歸、附子和肉桂等來達到活血化瘀、通絡止痛的功效，進一步抑制KOA模型大鼠炎癥因子、基質金屬蛋白酶和Hsp90α的表達，增強其COL-Ⅱ和Fn的蛋白表達，從而使軟骨基質的合成與降解處于動態平衡，減少軟骨細胞凋亡，延緩關節軟骨退變，發揮對關節軟骨的保護作用，并呈現劑量依賴性，尤以右歸丸高劑量組作用最為明顯。

綜上所述，右歸丸可能是通過“補益肝腎、活血化瘀、通絡止痛”等作用抑制KOA模型鼠炎癥因子和基質金屬蛋白酶的分泌并調控軟骨組織Hsp90α、COL-Ⅱ和Fn的蛋白表達來達到抑制軟骨細胞外基質降解、延緩關節軟骨退化、促進關節軟骨重構的目的，從而發揮治療作用。