mortalin蛋白在宮頸鱗癌中的表達及其對腫瘤轉移能力的影響*

王馨悅，李 楠，董 兵，楊 洋，林貞花

(延邊大學醫學院病理學教研室， 吉林省科技廳重點實驗室， 吉林 延吉 133002)

子宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，近年來，其發病率呈年輕化趨勢發展[1]。目前，子宮頸癌患者的死亡率位居女性惡性腫瘤首位，全球每年約有50萬新增病例，其中，28萬患者死于子宮頸癌[2]。子宮頸鱗癌是子宮頸癌最常見的組織學分型，發病隱匿，預后較差，嚴重威脅女性的生命健康。因此，尋找有效的治療靶點及預后生物標記物對子宮頸癌患者的早期診斷及預后評估至關重要。

壽命蛋白(mortalin)屬于熱休克蛋白70家族成員之一，最早被發現于小鼠胚胎成纖維細胞中，廣泛分布于胞漿及多個細胞器中[3]。研究表明，mortalin參與調控細胞周期、外界應激和腫瘤發生等多種生物學過程[4]，且在卵巢癌[5]、顱腦腫瘤[6]和結腸癌[7]等多種惡性腫瘤中高表達，并與腫瘤的轉移密切相關，但mortalin與子宮頸癌演進之間的關系尚未見報道。為此，本文旨在應用免疫組化法檢測mortalin在正常宮頸上皮組織和子宮頸鱗癌組織中的差異表達情況，并探討其表達水平與子宮頸鱗癌患者臨床病理參數及子宮頸鱗癌轉移之間的關系，進而為子宮頸鱗癌預后評估提供可能的分子指標。

材 料 和 方 法

1 臨床材料

臨床資料及隨訪信息齊全的宮頸組織標本選自2006年～2014年延邊大學醫學院腫瘤組織庫，部分購自上海芯超科技有限公司，包括59例正常宮頸上皮組織標本和93例子宮頸鱗癌組織。統計93例子宮頸鱗癌標本的臨床病理資料，包括：年齡<50歲的有51例，≥50歲的有42例；腫瘤<3.0 cm的有38例，≥3.0 cm的有55例；組織學分級Ⅰ級12例，II級66例，III級15例；依據國際TNM分期標準，0～II期63例，III～IV期30例；有淋巴結轉移者26例，無淋巴結轉移者67例。

2 試劑

mortalin抑制劑MKT-077購自Sigma；DMEM 培養基和新生牛血清 FBS 購自Gibco；熒光II抗及DAPI購自Invitrogen；抗E-cadherin、vimentin及 Snail抗體購自CST；抗mortalin抗體購自Abcam；抗β-actin抗體以及羅丹明標記的II抗購自中杉金橋公司。

3 方法

3.1免疫熒光染色 將SiHa細胞鋪于0.1 mm厚度的蓋玻片上，于5% CO2培養箱中培養，待細胞長至50%后，加入多聚甲醛室溫下固定15 min，以0.5%的Triton X-100 細胞打孔10 min，3% BSA室溫封閉2 h，滴加 I 抗(抗mortalin抗體1 ∶200 稀釋)，4 ℃過夜；熒光Ⅱ抗Alexa Fluro 488標記，室溫避光孵育1 h，DAPI封片固定；用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光染色結果，并照相記錄。

3.2MTT實驗檢測細胞活力 取對數生長期的SiHa細胞經胰酶消化、重懸，按每孔100 μL接種于96孔板內，每孔含2×104個細胞，設5個復孔；待細胞貼壁后按藥物濃度梯度加入mortalin抑制劑MKT-077，并按給藥時間梯度分別加入MTT(5 g/L)，4 h后加入二甲基亞砜溶液，振蕩10 min后用酶標儀在490 nm波長檢測吸光度(A)值并繪制細胞生長曲線。

3.3細胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞遷移能力 細胞常規消化、鋪板，待細胞長至80%用10 μL無菌槍頭沿孔底呈“一”字形劃痕，PBS液洗細胞3次后，加入無血清培養液培養，并分別于0、24和48 h拍照。

常規消化、計數細胞，取3×105個細胞，用100 μL無血清培養液重懸細胞后加入Transwell小室上室內，將1 mL含10%血清的培養液加入下室，37 ℃培養箱培養 24 h后甲醇固定，蘇木素染色，中性樹脂封片、拍照。

3.4Western blot檢測蛋白水平 RIPA裂解液裂解細胞后提取蛋白；BCA 法測定蛋白濃度；SDS-PAGE進行蛋白分離，轉至 PVDF 膜上；5% 脫脂奶粉搖床封閉2 h；加入 I 抗4 ℃ 過夜；TBS-T洗膜后加入 II抗；孵育 2 h；ECL曝光。

3.5免疫組化染色 制備4 μm厚連續切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，抗原修復，滴加抗mortalin抗體(稀釋比例1∶50)，4 ℃孵育過夜；次日滴加 II 抗，DAB顯色，蘇木素對比染色，中性樹膠封片。為證明mortalin抗體免疫組化檢測的特異性，選用mortalin強陽性染色的切片，以PBS代替 I 抗的染色結果作為陰性對照。以著色強度及著色細胞數綜合計算作為mortalin陽性染色評分標準。按陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按著色陽性細胞數計分：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度與著色細胞數得分相乘，0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～7分為中度陽性(++)，≥8分為強陽性(+++)。

4 統計學處理

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0統計學軟件進行分析。采用2檢驗或Fisher精確檢驗法進行臨床病理分析；計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示,兩獨立樣本間均數的比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 mortalin在SiHa細胞中的定位

免疫熒光結果顯示mortalin主要表達于SiHa細胞的細胞質中，見圖1。

Figure 1. The mortalin was mainly located in the cytoplasm of SiHa cells.
圖1 mortalin在宮頸癌SiHa細胞系中的胞質定位

2 mortalin在宮頸鱗癌組織中過表達

免疫組化染色顯示，mortalin在子宮頸鱗癌組織中過表達,mortalin在子宮頸鱗癌組織中表達的陽性率和強陽性率分別為89.2%(83/93)和62.4%(58/93)，顯著高于其在正常宮頸上皮組織中的表達(23.7%和5.1%，P<0.01)，見圖2、表1。

Figure 2. The protein expression of mortalin in cervical squamous-cell carcinoma tissues.
圖2 mortalin在正常宮頸組織和宮頸鱗癌組織中的表達

表1 mortalin在各組宮頸組織中的表達Table 1. Mortalin protein expression in cervical squamous-cell carcinoma tissues

**P<0.01vsnormal cervical epithelium.

3 mortalin表達與子宮頸鱗癌組織學分級、臨床分期及淋巴結轉移相關

對mortalin表達與子宮頸鱗癌患者臨床病理特征的關系進行分析，結果顯示mortalin表達與子宮頸癌組織學分級、臨床分期及淋巴結轉移密切相關，但與患者年齡和腫瘤大小無明顯相關性，見表2。

表2 mortalin表達與宮頸鱗癌臨床病理參數之間的關系Table 2. Correlation between mortalin expression and the clinicopathological features of cervical squamous cell carcinoma

4 mortalin表達下調通過EMT途徑抑制SiHa細胞的遷移

MTT實驗篩選mortalin抑制劑MKT-077作用的最佳濃度及時間為11.93 μmol/L和48 h，見圖3A，并通過Western blot實驗驗證在使用抑制劑后，mortalin的表達水平明顯下調(P<0.01),見圖3B。細胞劃痕及遷移實驗結果顯示，當mortalin受到抑制時，SiHa細胞的遷移能力顯著下降，見圖3C、D；進一步通過Western blot檢測EMT相關蛋白的表達水平，結果顯示抑制mortalin后，上皮表型標志物E-cadhe-rin的表達明顯上調，間充質表型標志物vimentin及Snail的表達明顯下調(P<0.01),見圖3B。

Figure 3. Inhibition of mortalin attenuated the migration ability of SiHa cells. A: the optimal concentration and dosing time of MKT-077 were evaluated by MTT assay; B: the protein expression of EMT-related molecules was determined by Western blot; C and D: the migration ability of SiHa cells was detected by wound-healing (×40) and Transwell migration (×200) assays. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
圖3 抑制mortalin對SiHa細胞遷移能力的影響

討 論

子宮頸癌是婦科三大惡性腫瘤之一，其中最常見的是子宮頸鱗癌，其發生和發展是一個復雜而多變的過程[8]。隨著醫學研究的不斷進步，診斷子宮頸癌的腫瘤標記物日益增多，主要包括CA125、p53、p16和Ki-67等，在其早期診斷、療效評估以及判斷預后等方面已具有一定的臨床意義[9]。近年來針對子宮頸癌治療靶點的研究多圍繞血管內皮生長因子、表皮生長因子受體及基質金屬蛋白酶等方面，但靶向治療仍處于初步階段，仍存在一些不足，如抗體的異質性、患者耐藥性及藥物引起的毒性反應等[10]。目前宮頸癌的早期診斷、進展期治療及預后仍不樂觀，因此，研究宮頸癌的潛在分子機制及尋求更有效的分子治療靶點對于宮頸癌患者的治療及預后至關重要。

mortalin屬于分子伴侶HSP70家族的一員，是人類HSPA9基因編碼的蛋白，其基因定位于染色體5q31.1上[11]。mortalin具有蛋白質修飾、免疫應答、參與胞內運輸和受體的內化等功能[12]。越來越多的研究表明，mortalin與腫瘤的進展密切相關。Yi等[13]報道,mortalin在肝癌組織中表達上調，并與患者的臨床分期及靜脈浸潤密切相關；Dundas等[7]發現,mortalin在結直腸癌中高表達，并與患者預后不良關系密切。有研究表明,mortalin可能與成纖維細胞生長因子、細胞漿J蛋白等相關，促進腫瘤細胞的增殖能力[14]；Iosefson等[15]研究證實,mortalin的衍生物通過促使p53的功能失活，使腫瘤細胞具有更強的增殖活性、遷移和轉移能力及在體內外形成腫瘤的能力；Hu等[16]在研究中發現mortalin蛋白可通過激活MAPK-ERK通路促進腫瘤的發生形成。上述研究提示mortalin的異位表達可能參與腫瘤的發生、發展過程。

本課題組前期研究發現，mortalin在乳腺癌組織中過表達，且與乳腺癌組織學分級、患者臨床分期、淋巴結轉移密切相關[17]；并發現其在胰腺導管腺癌組織中高表達且與胰腺導管腺癌患者臨床分期、神經周圍浸潤及淋巴轉移顯著相關[18]。在本研究中，免疫熒光染色法明確了mortalin在子宮頸鱗癌SiHa細胞中主要表達于細胞質，且免疫組化染色結果顯示其在子宮頸鱗癌組織中的表達水平顯著高于正常宮頸上皮組織。進一步分析mortalin高表達與宮頸癌臨床病理特征之間的關系，發現mortalin在晚期(Ⅲ～Ⅳ期)子宮頸鱗癌組織中的強陽性率(83.3%)顯著高于早期(0～II期)組織(52.4%，P=0.004)；在發生淋巴結轉移患者的子宮頸鱗癌組織中，mortalin表達強陽性率(80.8%)明顯高于無淋巴結轉移的組織(55.2%)，提示其與子宮頸鱗癌的轉移密切相關。Kang等[19]發現,mortalin促進了肝內膽管癌細胞EMT的發生;Na等[20]研究表明mortalin能夠促進EMT及腫瘤轉移。為進一步探究mortalin在子宮頸鱗癌轉移進展中的作用機制，本研究進行了細胞劃痕及遷移實驗，結果顯示抑制mortalin后，SiHa細胞的轉移能力明顯下降；檢測EMT相關蛋白表達水平后發現上皮表型標志物E-cadherin表達明顯上調，而間充質表型標志物vimentin及Snail表達明顯下調。上述結果與本課題組前期對于mortalin調控漿液性卵巢癌轉移及EMT進程的研究結果相符[21]，提示mortalin可能通過EMT途徑促進了子宮頸鱗癌的轉移。

綜上所述，mortalin在子宮頸鱗癌組織中表達明顯上調，結合mortalin表達與子宮頸鱗癌臨床病理學特征及轉移之間的關系，提示mortalin蛋白可能參與子宮頸鱗癌的演進。本研究對于判斷子宮頸鱗癌的進展及預后具有重要的臨床價值。