lncRNA MALAT1靶向調控miR-146b-5p影響膀胱癌細胞侵襲和遷移*

段 斌，符 浩，王昕禧

(南華大學附屬南華醫院泌尿外科， 湖南 衡陽 421002)

膀胱癌是常見實體惡性腫瘤，其早期的發病較為隱匿，且常常以隱匿性轉移為特點，因此研究膀胱癌轉移分子機制對于膀胱癌的治療具有重要意義[1-3]。肺腺癌轉移相關轉錄因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是一種近年來發現的長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA)，其在結直腸癌和肺癌等腫瘤中高表達，具有調控腫瘤細胞上皮-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)、侵襲和遷移等作用[4-5]。目前在膀胱癌中發現MALAT1高表達與膀胱癌患者淋巴轉移等有關[6]，但對于MALAT1影響膀胱癌細胞侵襲遷移的機制尚不明確。有研究表明，MALAT1可以下調肝細胞癌細胞中微小RNA(microRNA, miR)-146b-5p的表達從而促進腫瘤的發展[7]?；诖?，本實驗以膀胱癌BIU-87細胞作為體外研究對象，探討MALAT1和miR-146b-5p對膀胱癌細胞侵襲、遷移能力的影響和機制。

材 料 和 方 法

1 材料

膀胱癌BIU-87細胞購自廣東省醫學實驗動物中心腫瘤細胞庫。MALAT1 siRNA、siRNA control、miR-146b-5p mimics、mimics control、miR-146b-5p inhibitor和inhibitor control由上海吉瑪生物制藥有限公司構建合成；cDNA合成試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；定量PCR試劑購自TaKaRa；抗基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase，MMP-2)抗體購自Cell Signaling Technology；抗波形蛋白(vimentin)抗體和抗上皮型鈣黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadhe-rin)抗體購自Abcam；突變型和野生型螢光素酶報告載體由廣州輝駿生物科技有限公司構建；Lipofectamine 2000轉染試劑和TRIzol試劑購自Invitrogen；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成， MALAT1的上游引物序列為5’-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3’， 下游引物序列為5’-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGC-3’； miR-146b-5p的上游引物序列為5’-CCTGGCACTGAGAACTGAAT-3’， 下游引物序列為5’-GCACCAGAACTGAGTCCACA-3’； GAPDH的上游引物序列為5’-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下游引物序列為5’-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3’； U6的上游引物序列為5’-AGAGAGATTACATGGCCCCT-3’，下游引物序列為5’-CTAATGTCACGCACGATTCT-3’。

2 方法

2.1細胞轉染和敲減效果檢測 用Lipofectamine 2000將MALAT1 siRNA和siRNA control轉染至BIU-87細胞中，步驟同轉染試劑說明書。把轉染MALAT1 siRNA和siRNA control后的細胞設置為si-MALAT1組和si-con組，未轉染的細胞記為對照(control)組。Control、si-con和si-MALAT1組細胞在轉染48 h后，以real-time PCR檢測敲減效果。

用TRIzol方法提取細胞總RNA，RNA保存在-80 ℃。取2 μg的RNA，用Oligo dT反轉錄合成cDNA，步驟同cDNA合成試劑盒。合成cDNA保存在-20 ℃用于后續實驗。熒光定量PCR體系為0.4 μL的SYBR Green qPCR Super Mix-UDG、1 μL的cDNA、8.4 μL的DEPC水和0.4 μL的引物。PCR程序為:95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s，共40個循環。根據反應的Ct值計算MALAT1的表達水平，方法為常規2-ΔΔCt法，內參照設置為GAPDH。

2.2Transwell法檢測下調MALAT1后膀胱癌BIU-87細胞侵襲和遷移能力的變化 用不含血清的細胞培養液將control、si-con和si-MALAT1組細胞配制成濃度為1×109/L的單細胞懸浮液，將100 μL的細胞懸浮液添加到Transwell小室的上室中，在下室中添加含有10%胎牛血清的細胞培養液，放在37 ℃孵育48 h以后，用棉簽將沒有穿膜的細胞擦掉，用結晶紫染色后，在顯微鏡下隨機選取5個視野分析細胞遷移數目。侵襲實驗步驟同上，在侵襲實驗前用基質膠將小室濕化。

2.3Western blot檢測下調MALAT1后膀胱癌BIU-87細胞中MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白的表達水平 在轉染48 h后的control、si-con和si-MALAT1組細胞中添加蛋白裂解液，放在冰上充分裂解提取細胞中的總蛋白。制備SDS-PAGE蛋白凝膠，本次實驗以10%的分離膠和5%的濃縮膠進行電泳。在蛋白樣品中添加5×上樣緩沖液，放在100 ℃孵育5 min。每個孔中添加30 μg的蛋白樣品，marker上樣量為5 μL。濃縮膠中電泳電壓為80 V，分離膠中電泳電壓為120 V，觀察染料進入到膠板的底部以后，關閉電源，將凝膠取出。把裁剪好的NC膜放在甲醇中浸泡5 min，以100 V電壓在冰水混合物上轉膜，轉膜時間為80 min。把NC膜放在封閉液(含有5%脫脂奶粉的TBST)中，在室溫條件下孵育1 h。用封閉液配制 I 抗反應液(抗vimentin、E-cadherin抗體以1∶600稀釋，抗MMP-2抗體以1∶400稀釋)，把NC膜置于其中，在4 ℃孵育過夜。用封閉液配制1∶4 000稀釋的 II 抗反應液，NC膜置于其中在室溫條件下結合1 h。用ECL法化學發光，用Quantity One分析掃描灰度值，GAPDH設置為內參照，分析蛋白表達水平。

2.4靶向預測和雙螢光素酶報告系統的鑒定 利用生物信息學軟件Starbase 2.0分析得知MALAT1和miR-146b-5p有互補結合位點。將MALAT1結合序列突變，構建突變型螢光素酶報告載體(pmiRGLO-MALAT1-MUT)，同時構建沒有突變的螢光素酶報告載體(pmiRGLO-MALAT1-WT)。將MALAT1-MUT和MALAT1-WT與miR-146b-5p mimics和mimics control共轉染至BIU-87細胞中，培養48 h后，用螢光素酶活性檢測試劑盒檢測螢光素酶活性。設置轉染miR-146b-5p mimics和mimics control后的BIU-87細胞為miR-146b-5p組和miR-NC組。參照上述real-time PCR方法測定miR-146b-5p組和miR-NC組細胞miR-146b-5p的表達變化(內參照為U6)。同時用real-time PCR檢測control、si-con、si-MALAT1、vector(轉染陰性對照載體pcDNA3.1)和MALAT1(轉染pcDNA3.1-MALAT1)細胞中miR-146b-5p表達的變化(內參照為U6)。

2.5miR-146b-5p inhibitor和MALAT1 siRNA共轉染對膀胱癌BIU-87細胞侵襲、遷移能力和MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白表達的影響 在BIU-87細胞中共轉染miR-146b-5p inhibitor和MALAT1 siRNA及inhibitor control和MALAT1 siRNA，分別命名為Si-MALAT1+anti-miR-146b-5p組和si-MALAT1+anti-NC組，用real-time PCR、Transwell法和Western blot分別測定細胞中miR-146b-5p水平、侵襲及遷移數目和MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白表達變化。

3 統計學處理

實驗數據用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組數據間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差，組間比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MALAT1 siRNA下調膀胱癌BIU-87細胞中MALAT1表達水平

Real-time PCR結果顯示，si-MALAT1組膀胱癌BIU-87細胞中MALAT1表達水平明顯低于si-con組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The changes of MALAT1 expression in bladder cancer BIU-87 cells transfected with MALAT1 siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-con group.
圖1 MALAT1 siRNA轉染后膀胱癌BIU-87細胞中MALAT1表達的變化

2 下調MALAT1抑制膀胱癌BIU-87細胞侵襲、遷移和EMT

與si-con組比較，si-MALAT1組膀胱癌BIU-87細胞的侵襲和遷移數目明顯降低，同時細胞中MMP-2蛋白表達水平下降，間質細胞分子標志物vimentin蛋白水平降低，上皮細胞分子標志物E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，見圖2。下調MALAT1具有抑制膀胱癌BIU-87細胞的侵襲、遷移能力和EMT的作用。

Figure 2. The effect of down-regulation of MALAT1 on the number of invasion (A) and migration (B) of bladder cancer BIU-87 cells and the changes of MMP-2, vimentin and E-cadherin protein levels (C). Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-con group.
圖2 下調MALAT1后膀胱癌BIU-87細胞侵襲、遷移數目及MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白水平的變化

3 MALAT1靶向調控miR-146b-5p

生物信息學軟件預測MALAT1和miR-146b-5p有靶向結合位點，在細胞中轉染miR-146b-5p mimics后，細胞中的miR-146b-5p表達水平升高。MALAT1-WT和miR-146b-5p mimics共轉染后細胞螢光素酶活性降低。MALAT1可靶向調控miR-146b-5p表達，見圖3。

Figure 3. MALAT1 targeted regulation of miR-146b-5p expression. A: bioinformatics software predicted the targeting binding sites of MALAT1 and miR-146b-5p; B: expression of miR-146b-5p after transfection; C: luciferase activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.
圖3 MALAT1靶向調控miR-146b-5p

4 MALAT1負調控miR-146b-5p表達

si-MALAT1組BIU-87細胞中miR-146b-5p的表達水平明顯高于si-con組(P<0.05)。MALAT1組BIU-87細胞中miR-146b-5p的表達水平明顯低于vector組(P<0.05)，見圖4。MALAT1可以負向調控膀胱癌BIU-87細胞中miR-146b-5p的表達水平。

Figure 4. The effects of MALAT1 on miR-146b-5p expression in the bladder cancer BIU-87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-con group;&P<0.05vsvector group.
圖4 敲減或上調MALAT1的表達對膀胱癌BIU-87細胞中miR-146b-5p表達水平的影響

5 轉染miR-146b-5p inhibitor后，膀胱癌BIU-87細胞中miR-146b-5p的表達水平下降

si-MALAT1+anti-miR-146b-5p組膀胱癌BIU-87細胞中miR-146b-5p的表達水平明顯低于si-MALAT1+anti-NC組(P<0.05),見圖5。

Figure 5. Down-regulation of miR-146b-5p expression in bladder cancer BIU-87 cells after transfection with miR-146b-5p inhibitor. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-MALAT1+anti-NC group..
圖5 轉染miR-146b-5p inhibitor后,膀胱癌細胞中miR-146b-5p的表達水平下調

6 下調miR-146b-5p表達逆轉敲減MALAT1表達對膀胱癌BIU-87細胞侵襲、遷移能力和EMT的影響

與si-MALAT1+anti-NC組相比，si-MALAT1+anti-miR-146b-5p組膀胱癌BIU-87細胞的侵襲和遷移數目增加，MMP-2和vimentin蛋白水平增加，E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05),見圖6。下調miR-146b-5p可以逆轉敲減MALAT1表達對膀胱癌BIU-87細胞侵襲、遷移能力和EMT的影響。

Figure 6. Reversal effects of miR-146b-5p inhibitor on invasion, migration abilities and the protein expression of MMP-2, vimentin and E-cadherin of bladder cancer BIU-87 cells induced by knock-down ofMALAT1expression. A: the results of Transwell assays for determining the invasion and migration abilities of bladder cancer BIU-87 cells; B: the results of Western blot for determining the effects of co-transfection of miR-146b-5p inhibitor and MALT1 siRNA on the protein expression of MMP-2, vimentin and E-cadherin in the BIU-87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-MALAT1+anti-NC group.
圖6 miR-146b-5p inhibitor逆轉敲減MALAT1表達對膀胱癌BIU-87細胞侵襲、遷移能力和MMP-2、vimentin和E-cadhe-rin蛋白表達的影響

討 論

LncRNA的長度大于200 nt，不能編碼蛋白質，可以通過調控不同的基因表達參與生理和病理過程[8]。MALAT1又稱為NEAT2，是一個定位于染色體11q的LncRNA，MALAT1在哺乳動物體內十分保守，并且在不同組織臟器中的表達水平不同，其在肝臟和脊髓等組織中高表達，在食管組織及宮頸上皮組織中表達水平極低[9]。目前對于MALAT1的研究對象主要是腫瘤，在食管癌和宮頸癌等惡性腫瘤中發現MALAT1表達量升高，并且其表達水平越高腫瘤轉移能力也越強，MALAT1在腫瘤中可能發揮類似癌基因的作用[10-12]。MALAT1具有調控腫瘤細胞轉移潛能的作用，MALAT1在卵巢癌和骨肉瘤等腫瘤EMT、侵襲等過程中發揮誘導功能[13-14]。在膀胱癌的研究報道中顯示，MALAT1高表達可能是腫瘤轉移的標志[15]。本實驗發現MALAT1 siRNA下調膀胱癌細胞中MALAT1表達后，腫瘤細胞侵襲、遷移能力降低，這與上述在其它腫瘤中的研究結果一致，均提示MALAT1可能是一種腫瘤轉移促進因子。

我們的實驗還發現敲減MALAT1表達后的膀胱癌細胞中的MMP-2蛋白表達水平降低，細胞中vi-mentin蛋白水平也降低，而E-cadherin蛋白水平升高，說明MALAT1具有調控膀胱癌細胞中MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白表達的作用。MMP-2是一種與腫瘤轉移關系最為密切的基質金屬蛋白酶，其可以將細胞外基質降解，為腫瘤細胞的侵襲提供條件[16]。E-cadherin是上皮細胞分子標志物，vimentin是間質細胞分子標志物，vimentin表達上調和E-cadherin表達下調是細胞EMT的標志，而腫瘤細胞EMT發生在腫瘤轉移早期[17]。我們的實驗說明下調MALAT1可以抑制膀胱癌細胞EMT，下調MALAT1抗腫瘤轉移機制可能與其抑制腫瘤細胞EMT和合成MMP-2有關。

LncRNA發揮生物學功能與調控下游靶基因的表達有關，在很多腫瘤中已經發現LncRNA可以通過靶向調控miRNA的表達發揮促癌或抑癌作用[18]。我們的實驗發現MALAT1與miR-146b-5p有互補結合位點，并且證實膀胱癌細胞中MALAT1靶向負調控miR-146b-5p的表達。miR-146b-5p是一個在多種腫瘤中表達下調的miRNA，參與腫瘤細胞生長、分化和侵襲等，miR-146b-5p能夠將細胞周期阻滯在G0/G1期，并且可以抑制細胞因子TGF-β1、MCP-1和TNF-α的表達[19-20]。在肝癌的研究報道中已經表明，MALAT1能夠下調miR-146b-5p表達而促進肝癌細胞侵襲和遷移[7]。本次實驗還發現下調miR-146b-5p可以逆轉敲減MALAT1表達對膀胱癌細胞侵襲、遷移和EMT的作用，提示敲減MALAT1表達可通過miR-146b-5p調控膀胱癌細胞的侵襲、遷移能力和EMT，這與在上述肝癌細胞的研究結果相符合，說明MALAT1參與腫瘤轉移機制與調控miR-146b-5p有關。

總而言之，下調MALAT1可促進miR-146b-5p表達，抑制膀胱癌細胞EMT和合成MMP-2，進而發揮抑制膀胱癌細胞侵襲、遷移的作用。