TRIM25泛素化IGF2BP3后抑制食管癌EC109細胞的活力*

曾 濤，溫劍虎，王繼相

(1 四川綿陽四○四醫院胸外科， 四川 綿陽 621000; 2重慶醫科大學附屬第一醫院胸心外科， 重慶 400016)

泛素化是一種多翻譯后特異性修飾過程，其在多種細胞進程中發揮調控作用，包括細胞周期，細胞增殖，DNA復制和細胞凋亡等[1]。越來越多的證據表明，泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system，UPS)在腫瘤的發展中起著重要作用[2]。在泛素化過程中，泛素連接酶能夠將泛素分子與目的蛋白連接起來。泛素連接酶含三重基序蛋白25(tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)被認為與多種腫瘤有關，其可能通過泛素蛋白酶體系統靶向細胞周期來調控腫瘤細胞的生長[3]。值得注意的是，TRIM25在具有較低TRIM25表達的GC細胞系中的異位表達能夠顯著促進其遷移和侵襲。另一方面，已有報道顯示胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白3(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3，IGF2BP3)也能通過局部翻譯IGF2BP3結合的轉錄物促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[4]。Choudhury等[5]通過免疫沉淀TRIM25后質譜分析暗示了TRIM25和IGF2BP3可能存在相互作用。同時，食管癌中存在TRIM25低表達且IGF2BP3高表達的現象[6]。因此，為了探究TRIM23和IGF2BP3表達與食管癌EC109細胞活力的關系，我們進行了如下研究。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人食管癌細胞系EC109購自中科院上海細胞庫(貨號 3111C0001CCC000246)。IGF2BP3和ubiquitin (UB)的質粒購自北京中原公司(ADDGNE貨號 #19879和#74218)；TRIM25的質粒購自上海權陽生物有限公司(貨號TC07931)；Lipofectamine 2000(貨號11668027)和胎牛血清(貨號10099-133)購自Thermo Fisher Scientific；RPMI-1640培養基購自GE Health(貨號SH30091)；抗IGF2BP3、TRIM25、MYC和HA抗體購自CST(貨號 57145、13773、2276和3724)；Protein A/G免疫沉淀磁珠(貨號B23201)和蛋白酶抑制劑Cocktail(不含EDTA，mini片劑)購自Bimake(貨號B14011)；蛋白酶體抑制劑MG132購自SELLECK(貨號S2619)；PBS購自生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號E607008)；青鏈霉素混合液(100×)購自北京索萊寶科技有限公司(貨號P1400)；2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司(貨號WB-0081)；蛋白裂解液購自碧云天生物技術有限公司(貨號P0013)；TRIM25的siRNA序列為5’-AGGCUCUGUUCAAUCUCCUC-3’，IGF2BP3的siRNA序列為5’-CCAUAAAUUCUUCCCUGAGC-3’，由上海生工合成。

Western blot裝置(Bio-Rad)；酶標儀、細胞培養箱和生物安全柜(Thermo Fisher Scientific)；微量加樣器(Gilson)；冷凍離心機(Eppendorf)；旋轉搖床(海門其林貝爾)；脫色搖床(北京大龍)。

2 實驗方法

2.1細胞培養和藥物處理 將食管癌EC109細胞分為過表達TRIM25組、過表達IGF2BP3組、敲減TRIM25組和敲減IGF2BP3表達且過表達TRIM25組。食管癌EC109細胞維持在含有2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%熱滅活FBS的RPMI-1640培養基中，并在潮濕氣氛(37 ℃、5% CO2)中培養。環己酰亞胺(cycloheximide,CHX)以終濃度40 mg/L處理EC109細胞；MG132以終濃度為5 μmol/L處理EC109細胞，8 h后收獲細胞。

2.2細胞轉染 通過Lipofectamine 2000轉染EC109細胞。將含目的基因的質粒與脂質體混合靜止大約20 min后，緩緩滴入EC109細胞。于12孔板中實施劑量依賴性實驗。

2.3Western blot實驗 進行10%或12%SDS-PAGE，然后轉移到Immobilon-P PVDF膜(0.45 μm孔徑)。將PVDF膜在室溫下用含有0.01%Tween-20和5%脫脂奶粉的Tris緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl)封閉1 h，然后在4 ℃下與目的蛋白的抗體溫育過夜。然后將膜在室溫下與綴合有HRP的相應 II 抗孵育1 h。觀察特定蛋白質使用ECL Plus Western blot檢測系統。

2.4免疫共沉淀實驗 EC109細胞在1 mL NP-40裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1% Nonidet P-40, 10 mg/L抑肽酶，10 mg/L亮抑酶肽和1 mmol/L苯甲基磺酰氟)中裂解。在14 000×g，4 ℃條件下離心15 min，立即將上清液轉移到新管中。用PBS洗滌Protein A/G瓊脂糖珠2次，并制成50% Protein A/G瓊脂糖工作液(PBS中)。 在水平振蕩器上4 ℃振蕩10 min(此步驟旨在消除非特異性結合蛋白)。在14 000×g、4 ℃條件下離心15 s，將上清液轉移到新管中并丟棄Protein A/G瓊脂糖。加入適量的Ⅰ抗至總體積約500 μL。旋轉振蕩器上于4 ℃緩慢搖動過夜。在14 000×g、4 ℃條件下離心15 s，保持沉淀并用預先冷卻的洗滌緩沖液(或冷PBS)洗滌3次。加入15 μL SDS-loading buffer，100 ℃水浴5 min后取7 μL進行Western blot分析。

2.5MTT實驗檢測細胞活力 第1天用胰蛋白酶消化EC109細胞，將EC109細胞稀釋至 7.5×107/L(使用完全培養基稀釋細胞)。向96孔板的每孔中加入100 μL細胞(總共7 500個細胞)并孵育過夜。第2天處理細胞，且最終每孔體積為100 μL。第3天，向每個孔中加入20 μL MTT(5 g/L),包括一組加入MTT但沒有細胞的孔(對照)。在培養箱中37 ℃孵育3.5 h。小心取出96孔板，加入150 μL DMSO，用錫箔覆蓋并在軌道振蕩器上攪拌細胞15 min。在酶標儀中讀取590 nm處的吸光度(A)值。

2.6CCK-8實驗檢測細胞活力 在96孔板中分配100 μL EC109細胞懸浮液(每孔5 000個)。將板在潮濕的培養箱中預孵育24 h(37 ℃、5% CO2條件下)。將10 μL不同濃度的待測物質加入板中。將培養板在培養箱中孵育適當的時間(0 d、1 d、2 d、3 d和4 d)。向板的每個孔中加入10 μL CCK-8溶液。將培養板在培養箱中孵育4 h。使用酶標儀測量450 nm處的吸光度值。

3 統計學處理

使用library(VIM)中aggr(env, prop=T, numbers=T) 函數將信息缺失比例大于20%的無效信息可視化后手工剔除，用最高頻率或通過變量的相關關系填補缺失值后先錄入Epidata建立數據庫，再導入SPSS 23.0進行統計分析。計量數據用均數±標準差(mean±SD)表示。MTT和CCK-8實驗中組間比較使用三因素方差分析(three-way ANOVA)；蛋白條帶通過ImageJ軟件定量后組間差異采用Student’st檢驗分析。計數數據用例數(n)表示。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 過表達TRIM25抑制食管癌EC109細胞的活力

MTT實驗結果顯示，與vector組相比，轉染0.5、1和2 μg HIS-TRIM25后，食管癌EC109細胞的活力在第2天和第3天受到明顯抑制；且隨著TRIM25表達量的升高，食管癌EC109細胞的活力抑制越明顯(P<0.01)，見圖1。CCK-8實驗結果顯示，過表達TRIM25后EC109細胞的活力在第2天、第3天和第4天受到明顯抑制(P<0.05);而敲減TRIM25表達對EC109細胞的活力在第2天、第3天和第4天有明顯的促進效應(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. Over-expression of TRIM25 inhibited the viability of EC109 cells (measured by MTT assay). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group at the same time point.
圖1 MTT法檢測過表達TRIM25對食管癌EC109細胞活力的抑制作用

Figure 2. The changes of EC109 cell viability measured by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group at the same time point.
圖2 CCK-8法檢測EC109細胞活力的變化

2 過表達IGF2BP3促進食管癌細胞的活力

MTT實驗結果顯示，與vector組相比，轉染0.5、1和2 μg MYC-IGF2BP3對食管癌EC109細胞的活力在第2天和第3天有明顯的促進效應，且隨著IGF2BP3表達量的升高,EC109細胞活力的增高越明顯(P<0.01)，見圖3。CCK-8實驗結果顯示，過表達IGF2BP3后，EC109細胞的活力在第2天、第3天和第4天明顯增高(P<0.05);敲減IGF2BP3表達后，EC109細胞的活力在第2天、第3天和第4天受到明顯抑制(P<0.05)，見圖4。

Figure 3. Over-expression of TRIM25 promoted the viability of EC109 cells (measured by MTT assay). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group at the same time point.
圖3 過表達TRIM25促進食管癌細胞的活力

Figure 4. The changes of EC109 cell viability detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group at the same time point.
圖4 CCK-8法檢測EC109細胞活力的變化

3 敲減IGF2BP3表達和過表達TRIM25對食管癌EC109細胞的活力無明顯影響

過表達TRIM25后EC109細胞的活力受到了抑制(P<0.05)，與前面的結果相吻合； 敲減IGF2BP3表達抑制EC109細胞的活力(P<0.05)，也與前面的結果相吻合;敲減IGF2BP3表達的同時過表達TRIM25可抑制EC109細胞的活力，但其抑制程度與單純敲減IGF2BP3表達的EC109細胞相比差異無統計學顯著性(P>0.05)， 見圖5。

Figure 5. No significant change in the viability of esophageal cancer EC109 cells when knock-down ofIGF2BP3expression and over-expression of TRIM25 measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖5 敲減IGF2BP3表達同時過表達TRIM25對食管癌細胞的活力無明顯影響

4 過表達TRIM25導致IGF2BP3的表達量減少

當梯度過表達TRIM25時，內源IGF2BP3的表達量會梯度減少，提示泛素E3連接酶TRIM25會對 IGF2BP3進行泛素化修飾，且修飾后的IGF2BP3會被蛋白酶體降解,見圖6。

Figure 6. Over-expression of TRIM25 resulted in reducing IGF2BP3 expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.
圖6 過表達TRIM25導致IGF2BP3的表達量減少

5 過表達TRIM25后用MG132處理食管癌細胞，IGF2BP3的表達量無明顯變化

當用蛋白酶體抑制劑MG132處理食管癌EC109細胞時，即使梯度過表達TRIM25，IGF2BP3的表達量也沒有減少，見圖7。這表明TRIM25對IGF2BP3表達量的影響是蛋白酶體依賴性的。

Figure 7. The expression of IGF2BP3 in EC109 cells treated with MG132 after over-expression of TRIM25. Mean±SD.n=3.
圖7 過表達TRIM25后用MG132處理食管癌細胞，IGF2BP3的表達量無明顯變化

6 TRIM25與IGF2BP3存在相互作用

在只轉染HIS-TRIM25和空載體的對照組中，未能檢測到TRIM25的存在，只有當MYC-IGF2BP3和HIS-TRIM25共轉染時才能檢測到HIS-TRIM25, 說明TRIM25與IGF2BP3存在相互作用，見圖8。

Figure 8. TRIM25 interacted with IGF2BP3.
圖8 TRIM25與IGF2BP3存在相互作用

7 過表達TRIM25使IGF2BP3的泛素化程度增加

當過表達TRIM25時，與未過表達TRIM25的對照組相比，免疫沉淀后的IGF2BP3多聚泛素化鏈明顯增加，而未過表達UB的陰性對照卻無此種現象，見圖9。這表明過表達TRIM25會使IGF2BP3的泛素化程度增加。

Figure 9. Over-expression of TRIM25 increased the degree of ubiquitination of IGF2BP3.
圖9 過表達TRIM25會使IGF2BP3的泛素化程度增加

討 論

泛素化過程中，泛素分子介導的信號傳導經常在癌細胞中改變。幾種腫瘤抑制因子和癌基因與泛素-蛋白酶體途徑的相關酶存在相互作用，并在泛素綴合和解偶聯中起作用[7]。越來越多的證據表明，泛素-蛋白酶體系統在腫瘤的發展中起著重要作用。在本研究中，IGF2BP3能被泛素分子修飾，并且經UPS降解。

含有三聯基序的TRIM25也被稱為雌激素反應鋅指蛋白，是TRIM蛋白家族的成員[8]。TRIM25含有RING指結構域，2個B-box結構域和1個卷曲螺旋結構域，并起到泛素E3連接酶的作用[9]。已經在TRIM25基因的3’非編碼區鑒定出雌激素反應元件，且其表達由雌激素誘導[10]。據報道，TRIM25在乳腺癌和卵巢癌中過表達。但在子宮內膜癌中，TRIM25表達下調[11-13]。在本研究中，當過表達TRIM25時，食管癌細胞的增殖受到抑制，而沉默TRIM25后，食管癌細胞的增殖和活力受到明顯促進。TRIM25在某些腫瘤中低表達而在另一些腫瘤中又是高表達，提示腫瘤中的TRIM25是一種雙向調節泛素E3連接酶。

RNA結合蛋白參與RNA成熟，RNA轉換，蛋白質翻譯，整個細胞中轉錄物的移動等多個方面[14]。IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3屬于RNA結合蛋白的保守家族[15]。編碼IGF2BP3的基因最初被鑒定為編碼含有KH結構域的RNA結合蛋白的基因。IGF2BP3不存在于正常胰腺組織、胰腺良性病變或慢性胰腺炎中[16]，但是該蛋白在胰腺導管腺癌中過表達。IGF2BP3能結合mRNA的3’非編碼區來防止HeLa細胞中CD44 mRNA的降解[17]。 IGF2BP3還可受IGF2的轉錄后調節并通過PI3K/MAPK通路來誘導細胞增殖和侵襲[18-19]。在本研究中，過表達IGF2BP3可促進食管癌EC109細胞的活力，而敲減IGF2BP3表達使食管癌EC109細胞的活力受抑制；但敲減IGF2BP3表達的同時過表達TRIM25不會改變食管癌EC109細胞的活力；當過表達TRIM25時，IGF2BP3的表達量減少，但是用蛋白酶體抑制劑MG132處理可避免此效應的產生；并且TRIM25與IGF2BP3存在相互作用。與此同時，過表達TRIM25增加IGF2BP3的泛素化程度。基于此，推測在食管癌細胞中，TRIM25通過泛素化修飾IGF2BP3后，IGF2BP3被蛋白酶體識別并被降解，細胞中IGF2BP3的蛋白水平減少，PI3K/MAPK通路受到抑制，進而最后影響食管癌細胞的活力。本研究發現，IGF2BP3能夠被泛素蛋白酶體系統降解。泛素與目的蛋白的共價結合主要存在K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63共7種形式，其中，泛素與目的蛋白通過K48的結合會被泛素蛋白酶體系統降解[20],提示TRIM25至少會對IGF2BP3進行K48的泛素化修飾。

雖然本文就TRIM25、IGF2BP3表達與食管癌EC109細胞活力關系作出闡釋，但受研究時間和工作量的限制，本文未對TRIM25及IGF2BP3在食管癌瘤組織或細胞中的表達模式進行深入研究。下一步，我們擬擴大實驗規模，分析在TRIM25泛素化IGF2BP3使其被蛋白酶體降解以此抑制EC109細胞活力過程中的分子機制。

綜上所述，TRIM25泛素化IGF2BP3使其被蛋白酶體降解，由此抑制食管癌EC109細胞的活力。