切應力通過Pim1/eNOS途徑調節人臍靜脈內皮細胞NO分泌*

張 敏，孫 玉，唐平靜，張文君，王漢琴△

(湖北醫藥學院附屬隨州醫院 1轉化醫學研究中心， 2麻醉科， 湖北 隨州 441300； 3十堰市太和醫院超聲影像科， 湖北 十堰 442000)

一氧化氮(nitric oxide, NO)的產生由內皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)介導。蛋白激酶B(Akt)/eNOS通路是流體切應力調節內皮NO分泌的經典途徑[1]。研究表明，切應力對eNOS的活化不僅可由Akt介導，也可以通過激活蛋白激酶A[2]、接頭蛋白Gab1[3]及核心蛋白glypican-1[4]等而誘導eNOS的活化。

Pim(proviral integration of MMLV)家族是一組編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase)的原癌基因。血管內皮生長因子可通過Pim1誘導體外培養的血管內皮細胞eNOS磷酸化，在調節內皮細胞的血管生成中起作用[5]。Pim1和Akt同屬絲/蘇氨酸蛋白激酶，二者能夠直接磷酸化相同底物共同調控細胞生長[6-7]。前期工作我們利用平行平板流動腔系統，顯示Pim1對切應力敏感，動脈大小的層流切應力可以誘導其表達[8]。因此，我們提出這樣一個假設，切應力是否也可以通過Pim1調節血管內皮細胞NO分泌？

本研究利用平行平板流動腔系統，對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)施加15 dyn/cm2層流切應力(laminar shear stress)后，檢測Pim1基因的表達，探討Pim1是否在切應力調節NO的分泌中起作用，從力學生物學角度了解血管eNOS/NO信號轉導的途徑。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

胎牛血清和M199培養基購自Gibco；EGMTM-2內皮細胞生長培養液(Lonza)購自Allendale；TRIzol購自Invitrogen；逆轉錄試劑盒購自Thermo。SYBR Green Supermix購自Bio-Rad;兔抗Pim1多克隆抗體購自Millipore；兔抗eNOS和p-eNOS (Ser1177)多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；小鼠抗GAPDH單克隆抗體購自碧云天；堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG和馬抗小鼠IgG購自鼎國昌盛生物技術公司；LipofectamineTM3000購自Invitrogen;其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。BioTek Epoch酶標儀；Bio-Rad熒光定量PCR儀(CFX ConnectTMReal-Time PCR Detection System);平行平板流動腔加載裝置購自上海泉眾機電科技有限公司。

2 方法

2.1HUVECs的培養及鑒定 取新鮮新生兒臍帶(湖北醫藥學院附屬隨州醫院產科提供，標本采集經過患者家屬知情同意及醫院倫理委員會通過)，根據臍帶解剖結構找到臍靜脈后用0.125%胰酶消化，注意讓胰酶充分與血管內皮層接觸，持續消化10 min，用含血清的培養基終止消化，低速離心細胞懸液，再將懸浮液接種在用0.1 g/L多聚賴氨酸包被的培養瓶中，EGMTM-2內皮細胞生長培養液培養，置于5% CO2、37 ℃培養箱中，1～2 d左右換液1次，大約7 d長至融合狀態。胰酶消化后傳代，免疫熒光鑒定，取第2～4代用于實驗。

2.2流體切應力加載 平行平板流動腔系統用于流體切應力加載。該系統包括蠕動泵、儲液瓶、管道及流室。流室流道高度0.03 cm、寬度2.4 cm。細胞沿中軸方向種植于7.5 cm×2.4 cm×0.01 cm(長×寬×高)、經過0.1g/L多聚賴氨酸包被的玻璃載玻片上。通過此裝置，細胞可接受到穩定的層切應力刺激。采用τ=6μQ/wh2計算切應力強度。本實驗通過調節恒流泵大小改變Q值，調整切應力強度以達到實驗所需值。

2.4siRNA干擾實驗 依據GenBank中人Pmi1基因全長cDNA序列，委托上海生工合成特異性靶向Pim1基因的siRNA片段。待HUVECs生長融合至80%時，用LipofectamineTM3000介導siRNA轉染，實驗方法按說明書進行，轉染36 h后，real-time PCR檢測。陰性對照RNA(scrambled siRNA，siScr)序列正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。篩選出最佳siPim1序列正義鏈為5’-GCCCUGAGACCAUCAGAUATT-3’，反義鏈為5’-UAUCUGAUGGUCUCAGGGCTT-3’。未轉染組作為空白對照。

2.5實驗分組 本實驗切應力大小為15 dyn/cm2層流切應力，加載時間為15 min。實驗分2組，切應力加載(shear)組和靜止對照(static)組。HUVECs分別轉染siScr和siPim1后，再移入平行平板流動腔，切應力加載組siScr+shear和 siPim1+shear為實驗組，靜止組siScr+static和siPim1+static為平行對照。

2.6RT-qPCR實驗 采用TRIzol提取細胞總RNA，使用逆轉錄試劑盒獲得cDNA。Real-time PCR檢測Pim1表達，Pim1上游引物序列為5’-GCAAATAGCAGCCTTTCTGG-3’，下游引物序列為5’-CCTAGGACCCCTGGAGAGTC-3’；GAPDH上游引物序列為5’-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3’，下游引物序列為5’-CGCCCCACTTGATTTTGG-3’。每個樣品設置3個復孔，反應總體系為20 μL，PCR條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，61.4 ℃ 30 s，40個循環。GAPDH作為內參照，用2-ΔΔCt方法計算mRNA相對表達量。

2.7Western blot檢測 各組HUVECs用PBS清洗1次，加入含蛋白酶抑制劑的1×loading buffer，超聲波粉碎細胞后變性備用；用12%的SDS-PAGE，轉膜后用5%BSA室溫封閉2 h；Ⅰ抗(抗Pim1、eNOS、p-eNOS (Ser1177)和GAPDH抗體，1∶1 000比例稀釋)4 ℃搖床孵育過夜；Ⅱ抗(堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG和堿性磷酸酶標記的馬抗小鼠IgG，1∶800比例稀釋)，室溫孵育2 h；TBST清洗膜后加入NBT/BCIP顯色液顯色。以GAPDH作為內參照。

3 統計學處理

數據以均值±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0進行統計分析。兩組間均數比較采用Student’st檢驗;多組間均數比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

結 果

1 切應力對HUVECs中Pim1表達和NO分泌的影響

Western blot結果顯示，與static組相比，shear組HUVECs中Pim1蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖1A。NO分泌檢測結果顯示，shear組HUVECs NO的分泌量也顯著高于static組(P<0.05)，見圖1B。

Figure 1. Shear stress increased Pim1 expression (A) and NO release (B) in HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsstatic group.
圖1 切應力誘導HUVECs中 Pim1表達及NO分泌

2 切應力對HUVECs中eNOS 磷酸化的影響

Western blot結果顯示，與靜止對照組相比較，切應力作用5 min，磷酸化eNOS-Ser1177水平即顯著增高(P<0.05)，而且可以持續到30 min，見圖2。

Figure 2. Shear stress induced phosphorylation of eNOS at Ser1177 in HUVECs. Western blot was used to analyze p-eNOS (Ser1177) and total eNOS protein levels. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsstatic group.
圖2 切應力誘導HUVECs中eNOS-Ser1177的磷酸化

3 siPim1轉染對切應力誘導的Pim1表達的影響

HUVECs分別轉染siPim1和siScr后，RT-qPCR檢測Pim1 mRNA表達水平，評估siPim1的抑制效果，結果顯示，未轉染組和siScr組Pim1 mRNA表達無差異，而siPim1組Pim1 mRNA表達水平顯著低于siScr組(P<0.05)，見圖3A。將轉染后的細胞移入平行平板流動腔，Western blot結果表明，與siScr+static組比較，siScr+shear組Pim1蛋白表達顯著增加(P<0.05)；而與siScr+shear組比較，siPim1+shear組Pim1蛋白表達顯著被抑制(P<0.05)，見圖3B。

Figure 3.Pim1knockdown inhibited shear stress-induced Pim1 expression in HUVECs. A: the mRNA expression le-vel of Pim1; B: the protein level of Pim1 was analyzed by Western blot. Mean±SD.n=3.△P<0.05vssiScr group;*P<0.05vssiScr+static group;#P<0.05vssiScr+shear.
圖3 沉默Pim1抑制切應力誘導的Pim1表達

4 siPim1轉染對切應力誘導的HUVECs eNOS磷酸化和NO分泌的影響

Western blot及NO分泌檢測顯示，與siScr+static組比較，siScr+shear組HUVECs磷酸化eNOS-Ser1177水平及NO分泌量都顯著增加(P<0.05)；而與siScr+shear組比較，siPim1+shear組HUVECs磷酸化eNOS-Ser1177水平及NO分泌量都顯著被抑制(P<0.05),見圖4。

Figure 4.Pim1silencing attenuates phosphorylation of eNOS at Ser1177 and NO production in HUVECs. A: Western blot was used to analyze p-eNOS (Ser1177) and total eNOS protein levels; B: NO in cell culture medium was determined. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiScr+static group;#P<0.05vssiScr+shear group.
圖4 沉默Pim1抑制切應力誘導的eNOS磷酸化及NO產生

討 論

流體切應力是作用于血管內皮細胞最直接的一種力學刺激，在動脈粥樣硬化發生、發展中起重要作用。人動脈平均切應力大小在10 dyn/cm2～30 dyn/cm2之間，這種強度的切應力作用于血管內膜，可以刺激內皮細胞抗動脈粥樣硬化(anti-atherogenic)基因的表達，促進NO產生，使內膜保持抗動脈粥樣硬化表型[9]。本研究選擇15 dyn/cm2的層流切應力，觀察到在短時相15 min，HUVECs的Pim1蛋白表達就顯著上調。研究報道，血管內皮生長因子孵育HUVECs 20 min就顯著上調Pim1 mRNA表達水平[10]。我們用血小板源性生長因子刺激血管平滑肌細胞，在30 min時點，也觀察到Pim1 mRNA表達水平顯著上調[11]。這些結果可能和Pim1屬于“立早反應(immediate early response)”基因有關[12]。可能是細胞類型不一樣，刺激方式不一樣，Pim1表達發生改變的時間點有差別。

Pim1蛋白在結構上缺乏調節亞基，Pim1功能被認為與其表達量相一致[13]。本實驗我們首先檢測到加載切應力可上調Pim1蛋白表達，同時HUVECs的NO分泌量也升高，這提示Pim1可能在NO的分泌調節中起作用。為了進一步驗證這個假設，用小干擾RNA轉染HUVECs敲低Pim1表達，結果顯示切應力上調的Pim1 蛋白表達也被抑制，同時NO分泌平行降低。為此，我們初步認為在切應力作用下Pim1參與調節血管內皮細胞 NO分泌。

Dimmeler 等[1]在1999年首先發現切應力通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路激活eNOS 在絲氨酸第1 177 位點的磷酸化，增加血管內皮細胞NO合成和分泌。因此，我們還需要探討Pim1是否可以和Akt一樣，通過eNOS-Ser1177途徑調節NO產生。我們先重復了已有的研究，觀察了在切應力作用下HUVECs中的eNOS磷酸化水平，也證實切應力可以持續激活HUVECs中eNOS-Ser1177的磷酸化。然后，敲減HUVECs中Pim1表達，結果eNOS-Ser1177磷酸化也被抑制。這就說明切應力可能通過Pim1調節eNOS活性。當然，Pim1與Akt之間是否存在相互聯系，相關實驗仍在進行中。

綜上所述，切應力可短時相內增加HUVECs Pim1表達水平，同時伴隨eNOS-Ser1177磷酸化水平增加和NO的分泌增加。本研究初步證實了Pim1可通過eNOS信號參與切應力調節血管內皮細胞NO分泌，這可能是切應力調控內皮細胞NO分泌的信號途徑之一，但還需要更多研究進一步證實。