PERK通路在嗎啡保護心肌H9c2細胞過程中的作用*

趙 苗，韓雅茹，賀翼飛，付 宇，劉宇琳，習瑾昆，賀永貴

(華北理工大學附屬醫院， 華北理工大學臨床醫學院， 河北 唐山 063210)

心血管疾病是人類死亡的主要原因之一，死亡率遠高于包括腫瘤和艾滋病在內的其它疾病，成為了人類健康的“第一殺手”[1]。嗎啡(morphine)是阿片受體激動劑，它常用于心肌梗死引起的心絞痛。通過各種刺激破壞內質網穩態導致錯誤折疊蛋白質積累稱為內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。在心臟中，缺氧、缺血/再灌注、肥大、壓力超負荷和藥物誘導的損傷都可導致ERS，因而抑制ERS介導的心肌細胞凋亡對于改善心臟功能非常重要[2]。蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)通路是ERS信號通路的重要組成部分，影響著細胞在應激條件下的適應和存活。有研究表明，嗎啡可減輕心肌H9c2細胞缺氧復氧損傷，發揮心肌保護作用[3]；也有研究表明，PERK/eIF2α/ATF4途徑對間歇性缺氧細胞的保護發揮著重要作用[4]。氧化損傷可引起ERS，但是嗎啡發揮心肌保護作用是否與PERK通路有關尚未明確。因此，本研究探討嗎啡參與應激心肌的保護機制，為心血管疾病的預防及臨床治療提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 材料

來源于大鼠心肌組織的H9c2細胞(ATCC)。鹽酸嗎啡注射液(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司)；GSK2656157(MCE)；抗葡萄糖調節蛋白(glucose-regulated protein, GRP)78、GRP94、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、p-GSK-3β、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和GAPDH抗體(Cell Signaling Technology)；抗p-PERK抗體(Abcam)；TMRE熒光染料(Life Technologies Corporation)；ER-Tracker Red(Molecular Probes)；小鼠/兔聚合物法檢測系統通用型試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒、BeyoECL Plus試劑盒、噻唑藍(MTT)試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(碧云天生物技術研究所)。 FV 1000激光掃描共聚焦顯微鏡、BX53熒光正置顯微鏡和CKX31倒置相差顯微鏡(Olympus);550酶標儀(Bio-Rad)；電轉系統(北京市六一儀器廠)。

2 方法

2.1大鼠心肌H9c2細胞培養 H9c2細胞放置在培養箱中(95%空氣+5% CO2)，隔天更換培養基；當細胞鋪滿整個瓶底時，用0.25%胰蛋白酶根據需要進行處理傳代。

2.2實驗分組 觀察PERK抑制劑GSK2656157的最適濃度，實驗分為5組：0(control)、0.5、1、2和4 μmol/L組，用Western blot法檢測p-PERK蛋白水平。確定觀察嗎啡對氧化應激心肌的影響，實驗分為6組：control組、H2O2組(H2O2濃度為650 μmol/L)、H2O2+morphine組(嗎啡濃度為1 μmol/L)、H2O2+morphine+GSK2656157組(GSK2656157濃度為2 μmol/L)、morphine組和GSK2656157組。

2.3免疫組化法檢測GRP78和GRP94蛋白的表達 對無菌小皿中H9c2細胞進行培養，在細胞密度適當時給予細胞不同藥物處理，用PBS緩沖液將舊培養基沖洗干凈，并加入新的培養基；到達藥物作用時間后加入固定液(4%多聚甲醛)室溫30 min，PBS緩沖液沖洗殘余液體；加入0.5% Triton X-100室溫孵育20 min，用PBS緩沖液沖洗3次；隨后向視野好的細胞區域加入內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫放置10 min；PBS緩沖液沖洗3次；隨后滴加 I 抗和 II 抗進行處理，最后用適量現配的DAB顯色液顯色。

2.4Western blot法檢測蛋白表達 當H9c2細胞在無菌小皿中生長密度達到90%～95%時，根據實驗分組對細胞進行處理。藥物處理完畢后，將細胞裂解提取各組蛋白并進行定量分裝變性。各組蛋白通過電泳、轉膜，封閉；孵育抗GRP78、GRP94、p-PERK(1∶500稀釋)、CHOP、p-GSK-3β、GSK-3β和GAPDH(1∶1 000稀釋)抗體，放置于4 ℃過夜。第2天，孵育 II 抗(1∶2 000稀釋)室溫1 h后，ECL熒光顯色。ImageJ軟件對圖像進行灰度分析并統計。

2.5線粒體膜電位和內質網的檢測 將細胞分為6組，用PBS緩沖液沖掉共聚焦小皿中的死細胞和懸浮物，隨后臺氏液處理2 h，用線粒體的特異性熒光染料TMRE(100 nmol/L)預染細胞。在共聚焦顯微鏡下觀察TMRE紅色熒光強度，判斷線粒體膜電位變化，進而了解線粒體通透性轉移孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)的開放程度。觀察ER-Tracker Red熒光強度時，倒掉共聚焦小皿中的培養基，用PBS緩沖液沖洗，加入1∶1 000現配的且37 ℃預溫育20 min后的ER-Tracker Red(1 μmol/L)工作液，37 ℃溫育15 min，在共聚焦顯微鏡下進行紅色熒光強度觀察。檢測線粒體膜電位最大激發波長543 nm，最大發射波長560 nm；檢測內質網最大激發波長587 nm，最大發射波長615 nm。

2.6LDH和MTT試劑盒分別檢測細胞毒性和細胞活力 將 H9c2細胞懸液接種至96孔的細胞培養孔板，再將孔板置于37 ℃孵箱中；在顯微鏡下觀察細胞密度，到達90%左右時，按照實驗分組分別給與藥物。藥物作用完畢后分別按照LDH試劑盒和MTT試劑盒說明書進行操作。最后，在光鏡下觀察，用570 nm酶標儀檢測各孔的吸光度(A)。

3 統計學處理

實驗中數據利用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，以均數±標準差(mean±SD)表示。多組均值比較采用完全隨機設計的單因素方差(one-way ANOVA)分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 免疫組化檢測嗎啡對心肌H9c2細胞中內質網應激早期蛋白的影響

免疫組化法檢測顯示，與對照組相比，H2O2組棕黃色顆粒明顯增加，GRP78和GRP94蛋白為強陽性表達，morphine組與對照組無顯著差異；與H2O2組相比，用嗎啡預處理后棕黃色顆粒明顯減少，提示H2O2處理會引起內質網應激，嗎啡能抑制此過程，見圖1。

Figure 1. The effects of morphine on the protein expression of GRP78 和 GRP94 in the H9c2 cells were detected by immunohistoche-mistry (×200).
圖1 免疫組化檢測嗎啡對H9c2心肌細胞中GRP78和GRP94蛋白表達的影響

2 不同濃度的GSK2656157對心肌H9c2細胞中p-PERK蛋白表達的影響

與對照組相比，不同濃度(0.5、1、2和4 μmol/L)的PERK通路抑制劑GSK2656157均降低p-PERK的蛋白水平，并且在一定濃度范圍內，隨著抑制劑濃度的升高，抑制作用越明顯(P<0.05)，見圖2。因為在濃度為2 μmol/L和濃度為4 μmol/L時差異較小，蛋白水平都明顯降低，且濃度為2 μmol/L對細胞損傷較小，因此后續實驗中以2 μmol/L為作用濃度。

Figure 2. The effect ofGSK2656157 at different concentrations on the protein level of p-PERK in the H9c2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.
圖2 不同濃度GSK2656157對H9c2心肌細胞中p-PERK蛋白水平的影響

3 嗎啡對氧化應激的心肌H9c2細胞中GRP78和GRP94蛋白表達的影響

Western blot法檢測顯示，與對照組相比，H2O2組的GRP78和GRP94蛋白表達明顯增加(P<0.05)；嗎啡預處理可顯著降低H2O2增加的內質網應激相關蛋白GRP78和GRP94(P<0.05)的水平；加入PERK通路抑制劑GSK2656157后GRP78和GRP94蛋白表達進一步降低(P<0.05)，提示嗎啡明顯抑制H2O2引起的內質網應激，PERK通路可能參與此過程，見圖3。

Figure 3. Western blot was used for determining the protein levels of GRP78 and GRP94 in the H9c2 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖3 Western blot檢測心肌H9c2細胞中GRP78和GRP94的蛋白水平

4 嗎啡對氧化應激的心肌H9c2細胞中p-PERK和CHOP蛋白水平的影響

與對照組相比，H2O2處理后心肌 H9c2細胞的p-PERK和CHOP蛋白水平明顯增加(P<0.05)；用嗎啡預處理后，細胞中p-PERK和CHOP的蛋白水平明顯降低(P<0.05)，說明嗎啡抑制氧化應激引起的內質網應激；與H2O2+morphine組相比，采用GSK2656157處理后嗎啡進一步抑制H2O2損傷H9c2細胞的作用，p-PERK和CHOP蛋白水平明顯降低(P<0.05)，提示嗎啡可能通過抑制PERK通路參與抗氧化應激和心肌保護作用，見圖4。

Figure 4. Western blot was used for determining the protein levels of p-PERK and CHOP in the H9c2 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖4 Western blot檢測心肌H9c2細胞中p-PERK 和CHOP的蛋白水平

5 嗎啡對氧化應激的心肌H9c2細胞中GSK-3β磷酸化的影響

與對照組相比，H2O2處理使GSK-3β的磷酸化明顯減少(P<0.05)；嗎啡預處理明顯抑制H2O2所引起的GSK-3β的磷酸化變化(P<0.05)；而加入GSK2656157后則明顯增強了嗎啡的作用，GSK-3β的磷酸化明顯增加(P<0.05)，提示嗎啡可能通過抑制PERK通路使GSK-3β失活保護氧化應激作用下的心肌細胞，見圖5。

Figure 5. Western blot was used for determining the protein level of p-GSK-3β in the H9c2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖5 Western blot檢測心肌H9c2細胞中p-GSK-3β的蛋白水平

6 嗎啡對氧化應激的心肌H9c2細胞線粒體膜電位和內質網的影響

與對照組相比，H2O2處理使TMRE和ER-Tracker Red紅色熒光強度顯著降低(P<0.05)，說明H2O2導致心肌細胞線粒體膜電位降低，mPTP開放，內質網損傷；嗎啡預處理明顯抑制H2O2引起的熒光強度降低(P<0.05)；GSK2656157進一步加強了嗎啡的作用(P<0.05)，提示嗎啡可能通過抑制PERK通路阻止mPTP開放，減輕內質網損傷，發揮心肌細胞保護作用，見圖6、7。

Figure 6. The effect of morphine on mitochondrial membrane potential in oxidative stress-induced H9c2 cells (×400). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖6 嗎啡對氧化應激下的心肌H9c2細胞線粒體膜電位的影響

Figure 7. The effect of morphine on endoplasmic reticulum in oxidative stress-induced H9c2 cells (×200). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖7 嗎啡對氧化應激下的心肌H9c2細胞內質網的影響

7 嗎啡對氧化應激的心肌H9c2細胞的細胞毒性和細胞活力的影響

與對照組相比，H2O2處理后LDH值顯著上升，細胞毒性明顯增強，MTT實驗結果顯示細胞活力明顯減弱(P<0.05)；當用嗎啡預處理后，H2O2處理的心肌細胞的細胞毒性明顯減弱，細胞活力明顯增強(P<0.05)；加入GSK2656157阻斷了PERK通路后，進一步加強了嗎啡的作用(P<0.05)，見圖8、9。

Figure 8. The changes of the LDH levels. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖8 各組H9c2細胞培養上清液LDH活性的比較

Figure 9. The effects of morphine on the viability of H9c2 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖9 MTT法檢測嗎啡對心肌H9c2細胞活力的影響

討 論

急性心肌梗死是人類死亡的主要原因之一，在治療過程中，血液流向缺血區的同時會導致大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產生，它會造成心肌再灌注損傷(myocardial reperfusion injury，MRI)[5]；并且，當ROS含量超過體內抗氧化防御系統的閾值時，會發生氧化應激。氧化應激會導致錯誤折疊蛋白質增多并引起ERS，影響細胞穩態，導致內質網(endoplasmic reticulum，ER)功能障礙[6]。嗎啡及其衍生物被廣泛應用于醫學，包括腫瘤、急性心肌梗死、絞痛和分娩等[7]。有研究表明，嗎啡通過激活PKCε-ERK1/2通路保護缺血再灌注心肌[8]；也有研究表明，嗎啡能夠保護缺氧/復氧心肌[3]。

ERS會啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，它是一種在不利條件下細胞自我保護的基本生存機制，可進而導致細胞程序性死亡[9]。當細胞受到內外環境刺激時，GRP78和GRP94啟動UPR，激活PERK、需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)3條經典信號通路[10]。為了探究氧化應激能否引起ERS以及嗎啡能否抑制此過程，我們通過免疫組化檢測了ERS早期標志蛋白GRP78和GRP94的表達，結果顯示，H2O2組GRP78和GRP94蛋白為強陽性表達，棕黃色顆粒明顯增加，嗎啡明顯抑制此過程，說明氧化應激導致ERS，嗎啡抑制氧化應激引起的ERS。

PERK在GRP78解離時被激活，這種解離允許PERK二聚化和自磷酸化[11]，形成具有活性的p-PERK。CHOP是一種促凋亡轉錄因子，被ERS激活進而介導程序性細胞死亡即細胞凋亡。有研究表明， 缺氧早期通過PERK通路保護機體對抗缺氧損傷，后期激活細胞凋亡通路[12]；也有研究表明，肌原纖維形成調節因子1通過抑制PERK/Nrf2途徑而減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡[13]。PERK通路與缺氧心肌細胞保護密切相關。GSK2656157是一種與ATP競爭的高選擇性PERK抑制劑，能夠競爭性阻止ATP結合PERK蛋白，使PERK無法進行磷酸化，從而對該信號通路進行有效抑制。為了探究GSK2656157的最適濃度，我們觀察不同濃度(0、0.5、1、2和4 μmol/L)GSK2656157對PERK蛋白磷酸化水平的影響，結果顯示，2 μmol/L降低明顯，因此后續實驗以此作為濃度。

ERS伴侶蛋白GRP78和GRP94被轉錄翻譯，在UPR中起重要作用[10]。為了檢測氧化應激對ERS的影響，我們用H2O2制備氧化應激模型，觀察GRP78和GRP94的表達情況，結果顯示，H2O2使GRP78和GRP94的表達明顯增加，嗎啡明顯抑制此過程，GSK2656157進一步加強嗎啡的作用，提示氧化應激導致ERS，嗎啡明顯抑制氧化應激引起的ERS，PERK通路可能參與此過程。

ERS可導致雙鏈RNA激活的PERK自磷酸化，進一步激活CHOP，導致許多蛋白質合成受到抑制，并通過減弱鳥嘌呤核苷酸交換因子eIF2β限制蛋白質流入ER腔[14]。為了進一步驗證嗎啡是否通過抑制PERK通路發揮氧化應激保護作用，我們檢測了PERK和CHOP蛋白表達情況，結果顯示，H2O2使p-PERK和CHOP蛋白水平明顯增加，嗎啡明顯抑制此過程，GSK2656157加強嗎啡的作用，進一步說明氧化應激可以導致ERS，嗎啡通過抑制PERK-CHOP通路降低ERS，發揮心肌細胞保護作用。

氧化應激導致ROS大量積累，破壞心肌細胞線粒體內抗氧化應激系統平衡, 線粒體膜電位降低，mPTP開放[15]。GSK-3β活性與多種疾病密切相關，GSK-3β磷酸化(即失活)進而阻止mPTP開放是心肌保護的關鍵[8]。我們的前期研究也證實，黃芪甲苷可能通過抑制GSK-3β活性，進而阻止mPTP開放保護心肌[16]。在我們的實驗中，H2O2使GSK-3β磷酸化明顯減少，嗎啡明顯抑制此過程，GSK2656157進一步加強了嗎啡的作用，說明嗎啡可能通過抑制PERK使GSK-3β失活保護氧化應激的心肌細胞。

進一步用激光共聚焦顯微鏡檢測mPTP開放程度和內質網，結果顯示，H2O2使線粒體特異性熒光染料TMRE和內質網特異性熒光染料ER-Tracker的紅色熒光強度明顯減少，嗎啡明顯抑制紅色熒光強度的減少，GSK2656157進一步加強嗎啡的作用，此結果提示，嗎啡通過抑制PERK通路阻止mPTP開放，減輕內質網損傷，發揮心肌細胞保護作用。

此外，我們通過LDH試劑盒檢測細胞毒性，MTT試劑盒檢測細胞活力，結果顯示，H2O2使細胞毒性明顯增強，使細胞活力明顯減弱，嗎啡明顯抑制此作用，GSK2656157進一步加強嗎啡的作用，說明嗎啡能夠減輕氧化應激所致的細胞毒性，增強細胞活力，PERK通路參與嗎啡的心肌保護作用。

綜上所述，氧化應激導致心肌細胞損傷，嗎啡可能通過抑制PERK通路降低ERS,使GSK-3β失活進而阻止mPTP的開放，從而發揮心肌保護作用。嗎啡的心肌保護作用與“內質網-線粒體”對話機制密切相關，其詳細機制有待進一步探索。