外源茉莉酸甲酯對煙草幼苗耐冷性的影響

張海樅，邢雪霞，牛莉莉，魯宇童，張 林，劉 園*

(1.河南省煙草公司 南陽市公司，河南 南陽 473000； 2.河南中煙工業有限責任公司，河南 鄭州 450000； 3.紅云紅河集團 昆明卷煙廠，云南 昆明 650000)

茉莉酸甲酯(MeJA)是脂質衍生化合物，是植物應激反應和發育的關鍵信號化合物，在植物生長發育過程中具有重要的影響[1]。茉莉酸(JA)及其衍生物由在葉綠體膜的半乳糖脂中酯化的α-亞麻酸合成，物理損傷與逆境環境刺激可導致α-亞麻酸的產生與釋放，從而增加植物體內茉莉酸的含量。LIU等[2-5]研究發現，噴施外源MeJA能夠增強植株對低溫的抗性，使植株的抗氧化酶活性提高、丙二醛含量下降，也可通過提高抗寒轉錄因子的表達量從而提高植株的抗寒性，保護低溫下細胞的超微結構。MeJA還參與腺毛的分泌，腺毛對植株防御干旱及低溫等逆境具有重要作用[6]。

煙草是原產于熱帶亞熱帶的喜溫作物，低溫環境嚴重影響其生長發育[7]。低溫下葉綠體類囊體膜通透性增強致使細胞脫水及離子外泄，導致膜結構受損和膜脂過氧化等不良影響。隨著低溫環境時間的延長，葉綠體形態發生變化，光合色素含量顯著降低，進而使細胞代謝紊亂，當細胞內的運轉平衡被破壞時，細胞便會萎蔫，最終導致生長受阻。近年來，溫度變化趨勢使得低溫環境愈發嚴峻，已成為限制作物生長和農業可持續發展的環境因素[8-9]。K326和豫煙6號是河南烤煙生產的主栽品種，K326適應性較強，產質量較高，煙葉化學成分較協調[10]，但對低溫環境較為敏感[11]。豫煙6號的外觀質量和感官質量較好，具有一定的抗旱性和抗病性[12]，但對其低溫敏感程度未見系統的研究報道。為此，采用營養液培養法，研究外源MeJA對K326與豫煙6號幼苗耐冷性的影響，旨在進一步闡明外源MeJA應對低溫脅迫的生理機制，進而為MeJA在煙草幼苗上的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 烤煙品種 河南烤煙生產的主栽品種K326和豫煙6號(Y6)，由河南農業大學煙草學院提供。

1.1.2 試劑 95%茉莉酸甲酯(MeJA)，Sigma試劑公司；過氧化氫、甲硫氨酸、氮藍四唑、核黃素、愈創木酚、硫代巴比妥酸、酸性茚三酮、冰乙酸和蒽酮，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器 酶聯免疫檢測儀，瑞士TECAN集團公司；臺式離心機，德國Eppendorf國際貿易有限公司；電子天平，上海精密儀器儀表有限公司；便攜式Li-6400紅外氣體分析儀，Li-COR,Inc,Lincoln,NE,USA。

1.2 方法

1.2.1 播種及培養條件 煙草種子分別先用10%過氧化氫消毒8 h，再用純水沖洗干凈后播種。培養介質為育苗盤和潮濕的工字格海綿，水培營養液為Hoagland營養液；人工氣候培養箱環境：晝夜(28±2)℃/(18±2)℃，光周期為14 h/10 h循環，相對濕度70%，光照強度為22 000 lx。

1.2.2 試驗設計 當煙草長至4葉一心幼苗時將其移至蛭石中生長，保證其根部有足夠大的生長空間。在煙草幼苗長至6葉一心時選取長勢一致的幼苗移至水培盒采用營養液培養。采用單因素隨機試驗設計，2個品種試驗處理完全相同，試驗共設4個處理：CK，正常溫度，噴施等量清水；處理1，MeJA噴施濃度為0 μmol/L(即噴施等量清水)，處理2，MeJA噴施濃度為10 μmol/L；處理3，噴施MeJA濃度為100 μmol/L。3次重復，每個重復3株煙苗。處理1～3進行3 d正常溫度預處理，然后進行5 d低溫處理(低溫環境為晝夜11℃/8℃[13-14])，其余條件不變。在此生長期間每3 d換1次營養液，通氧2 h/d，在低溫處理的第5天分別選取2片真葉測定各生理生化指標。

1.2.3 指標測定

1) 煙草幼苗葉片鮮重、飽和重、干重及相對含水量。低溫處理第5天后稱量幼苗鮮重，然后放入清水中浸泡24 h充分吸水達到飽和后，測量其飽和重。再將幼苗先放入105℃烘箱殺青30 min，接著于70℃環境中烘干48 h至恒重后稱量其干重。通過鮮重、飽和重和干重計算葉片的含水量[15]和相對含水量。

含水量=(鮮重-干重)/鮮重×100%

相對含水量=(鮮重-干重)/(飽和重-干重)×100%

2) 抗氧化酶活性。取相同葉位葉片0.5 g，加入預冷的5 mL pH 7.8的磷酸緩沖液進行冰浴研磨，并冷凍離心20 min，上清液即酶活性提取液，于4℃冰箱中低溫保存。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)參照文獻[16]的方法測定。

3) 丙二醛、脯氨酸和可溶性糖。稱取相同葉位煙草葉片0.5 g測定不同滲透調節物質。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[17]測定，脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮比色法[18]測定，可溶性糖(WSS)含量采用蒽酮比色法[19]測定。

4) 光合作用參數。使用便攜式Li-6400紅外氣體分析儀在低溫處理5 d時，從9:00-11:00對煙株自上而下第3片完全展開葉進行光合數據的測定，保持葉室溫度維持在26～29℃，光強為 800 μmol/(m2·s)，CO2濃度為 400 μmol/mol。直接測定葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)，并計算葉片水分利用率(WUE)和氣孔限定值(Ls)。

WUE=Pn/Tr

Ls=1-Ci/Co

式中，Co為CO2的設定濃度。

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 外源MeJA處理低溫下2個煙草品種幼苗的生物量及相對含水量

從表1可知，不同處理低溫下K326和Y6的鮮重、干重和相對含水量的變化。K326：鮮重、干重和相對含水量均以CK最大，分別為24.14 g、2.33 g和87.96%；處理1最小，分別為10.35 g、1.54 g和78.55%；鮮重CK顯著大于其余處理，其余處理間差異顯著；干重CK顯著大于其余處理，處理1與處理2間和處理2與處理3間差異不顯著；相對含水量CK顯著大于其余處理，處理1顯著小于其余處理，處理2與處理3間差異不顯著。Y6：鮮重、干重和相對含水量均以CK最大，分別為25.41 g、2.22 g和88.86%；處理1最小，分別為11.72 g、1.55 g和79.37%；鮮重CK顯著大于其余處理，其余處理間差異顯著；干重和相對含水量CK均顯著大于其余處理，處理1顯著小于其余處理，處理2與處理3間差異不顯著。

表1 不同濃度外源 MeJA處理低溫下2個烤煙品種幼苗的生物量及相對含水量

2.2 外源 MeJA處理低溫下2個煙草品種幼苗的抗氧化酶活性

從圖1看出，不同處理低溫下K326和Y6幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性的變化。

2.2.1 K326 SOD，處理3最高，為204.35 U/g FW；CK最低，為51.92 U/g FW；處理3>處理2>處理1>CK；各處理間差異顯著。POD，處理2最高，為41.95 U/(g·min FW)；CK最低，為27.74 U/(g·min FW)；處理2>處理3>處理1>CK；CK顯著低于其余處理，處理2與處理3顯著高于處理1，二者間差異不顯著。CAT，處理2最高，為33.76 U/(g·min FW)；CK最低，為9.50 U/(g·min FW)；處理2>處理3>處理1>CK；各處理間差異顯著。

2.2.2 Y6 SOD、POD和CAT均以處理2最高，分別為212.54 U/g FW、47.03 U/(g·min FW)和35.85 U/(g·min FW)；CK最低，分別為55.55 U/g FW、30.15 U/(g·min FW)和10.45 U/(g·min FW)；均為處理2>處理3>處理1>CK；SOD、POD和CAT的各處理間差異顯著，CK顯著低于各處理，處理2顯著高于其余處理。

2.3 外源 MeJA處理低溫下2個煙草品種幼苗可溶性糖(WSS)、丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量的影響

從圖2看出，不同處理低溫下K326和Y6幼苗的可溶性糖(WSS)、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的變化。

2.3.1 K326 WSS和MDA均以處理1最高，分別為1.79%和2.89 μg/g Fw；CK最低，分別為0.29%和0.03 μg/g Fw；均為處理1>處理2>處理3>CK；各處理間差異顯著。Pro處理1最高，為1.58 μmol/g FW；CK最低，為0.09 μmol/g FW；處理1>處理3>處理2>CK；處理1顯著高于其余處理，CK顯著低于其余處理，處理2與處理3差異不顯著。

2.3.2 Y6 WSS、Pro和MDA均以處理1最高，分別為1.66%、1.41 μg/g Fw和2.63 μmol/g FW；CK最低，分別為0.31%、0.09 μg/g和0.03 μmol/g FW；均為處理1>處理3>處理2>CK；各處理間差異顯著。

2.4 外源 MeJA處理低溫下2個煙草品種幼苗光合作用參數的變化

從表2看出，不同處理低溫下K326和Y6幼苗的凈光合速率、氣孔導度和胞間CO2濃度等光合作用參數的變化。凈光合速率：K326和Y6分別為11.85～21.96mmol/(m2·s)和12.89～21.99 mmol/(m2·s)，均為CK>處理2>處理3>處理1；各處理間差異顯著。氣孔導度：K326和Y6分別為0.23～0.50mmol/(m2·s)和0.25～0.51 mmol/(m2·s)，均為CK>處理2>處理3>處理1；各處理間差異顯著。胞間CO2濃度：K326和Y6分別為326.26～357.47 μmol/mol和325.67～354.17 μmol/mol，均為處理1>處理3>處理2>CK；K326各處理間差異顯著，Y6處理2與處理3間差異不顯著，二者與其余處理間差異顯著。蒸騰速率：K326和Y6分別為3.67～5.26 mmol/(m2·s)和3.68～5.31 mmol/(m2·s)，均為CK>處理2>處理3>處理1；各處理間差異顯著。水分利用效率：K326和Y6分別為3.23～4.17 μmol/mol和3.50～4.14 μmol/mol，均為CK>處理2>處理3>處理1；K326各處理間差異顯著，Y6處理2與處理3間差異不顯著，二者與其余處理間差異顯著。氣孔限定值：K326和Y6分別為0.11～0.18和0.11～0.19，均為CK>處理2>處理3>處理1；K326各處理間差異顯著，Y6處理2與處理3間差異不顯著，二者與其余處理間差異顯著。

表2 不同濃度外源處理 MeJA低溫下2個煙草品種幼苗光合作用參數的變化

3 結論與討論

茉莉酸甲酯(MeJA)作用的主要機理是提高抗氧化酶的活性降低低溫造成的活性氧積累，進而使細胞保持完整性。研究結果表明，MeJA是響應脅迫環境的信號分子，能夠有效地抑制K326和Y6幼苗在低溫環境下的損傷，低溫下2個品種幼苗的生長發育均會受到不同程度的抑制，Y6抵御低溫的能力略好于K326。K326和Y6的鮮重、干重和相對含水量均以正常溫度處理最大，分別為24.14 g、2.33 g、87.96%和10.35 g、1.54 g、78.55%；低溫MeJA 0 μmol/L最小，分別為10.35 g、1.54 g、78.55%和11.72 g、1.55 g、79.37%。K326的超氧化物歧化酶(SOD)為低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 0 μmol/L>正常溫度，過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)均為低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 0 μmol/L>正常溫度；Y6的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性均為低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>MeJA 0 μmol/L>正常溫度。

滲透調節物質在植物逆境脅迫中占有重要位置，其指標含量表示對逆境的反應程度[20]。丙二醛(MDA)作為脂質過氧化指標，用于表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境反映的強弱。研究結果表明，K326的可溶性糖(WSS)和丙二醛(MDA)含量均為低溫MeJA 0 μmol/L>低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>正常溫度，Pro為MeJA 0 μmol/L>MeJA 100 μmol/L>MeJA 10 μmol/L>正常溫度。Y6的WSS、Pro和MDA均為MeJA 0 μmol/L>MeJA 100 μmol/L>MeJA 10 μmol/L>正常溫度。表明，茉莉酸甲酯能夠促進低溫下煙草對可溶性糖和脯氨酸的積累，減少丙二醛的積累。

研究結果表明，K326和Y6幼苗在低溫環境下的SOD、POD和CAT含量都顯著上升，并且在10 μmol/L MeJA處理時二者的抗氧化酶系統含量達最高。即外源MeJA的噴施會進一步增強信號傳導，使得抗氧化酶含量迅速上升，以減少脂膜過氧化的產生。滲透調節物質也是緩解逆境的重要組成成分[21]。可溶性糖、脯氨酸能夠維持酶結構的穩定和細胞滲透勢的水平，陳璇等[22]研究表明，短時間的低溫脅迫下，植物細胞組織液滲透濃度越高，其對寒冷的響應速度越快，抗寒性越強。丙二醛是衡量植物脅迫情況下生長狀況重要的生理指標。試驗結果表明，低溫下外源MeJA處理能夠提高可溶性糖和脯氨酸的積累，使其含量維持在較高的水平，增加細胞的持水力，防止植物組織受到冷害，也減少其MDA含量，有利于植物維持一定的滲透勢進而提高煙草幼苗的耐冷性。

光合作用是植物生長發育、積累干物質和產量形成的基礎，低溫環境會對光合作用產生不良影響。徐田軍等[23]研究表明，在低溫環境下導致光合作用降低的原因有兩方面：一是在輕度低溫脅迫時，氣孔因素導致植物光合作用降低，主要是植株葉片氣孔擴散的阻力增加，氣孔導度降低，進而吸收的二氧化碳含量降低，使產物運輸途徑受阻，最終導致凈光合速率下降；二是在重度脅迫時，非氣孔因素導致植物光合作用降低，具體表現為當光化學活性和RUBP羧化等受到限制時，阻礙二氧化碳的利用，從而造成細胞中的二氧化碳含量積累，而凈光合速率、氣孔導度仍然呈下降趨勢。胞間二氧化碳濃度的變化趨勢隨著脅迫時間的長短而變化，通常呈先降后升趨勢。研究結果表明，在低溫環境處理5 d后，K326和Y6不同處理凈光合速率分別為11.85～21.96 mmol/(m2·s)和12.89～21.99 mmol/(m2·s)，均為正常溫度>低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 0 μmol/L；胞間CO2濃度分別為326.26～357.47 μmol/mol和325.67～354.17 μmol/mol，均為低溫MeJA 0 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 10 μmol/L>正常溫度；蒸騰速率分別為3.67～5.26 mmol/(m2·s)和3.68～5.31 mmol/(m2·s)，均為正常溫度>低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 0 μmol/L；水分利用效率分別為3.23～4.17 μmol/mol和3.50～4.14 μmol/mol，均為正常溫度>低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 0 μmol/L；氣孔限定值分別為0.11～0.18和0.11～0.19，均為正常溫度>低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 0 μmol/L。氣孔的關閉雖然也是低溫造成葉片光合速率降低的原因，但胞間CO2濃度的上升和氣孔限定值的下降表明，煙草葉片光合速率下降的主要原因是葉肉細胞光合活性降低以及非氣孔因素所致，與衛丹丹等[24-25]的研究一致。說明經低溫脅迫后，2個品種的光合作用降低，而外源MeJA能夠對煙草幼苗的光合機構起保護作用；MeJA能夠抵抗低溫脅迫。K326在外源MeJA濃度為100 μmol/L時光合參數最接近正常溫度處理，Y6在外源MeJA濃度為10 μmol/L時光合參數最接近正常溫度處理。2個品種的光合參數與生物量、相對含水率變化程度一致，說明不同的品種對外源物質存在劑量效應。