探討多重聚合酶鏈反應系統用于兒童常見細菌及真菌血流感染的價值※

張 帥,倪 敏,王 幀,楊俊梅

(1.鄭州大學附屬兒童醫院/河南省兒童醫院/鄭州兒童醫院,河南 鄭州450000;2.鄭州大學第三附屬醫院,河南 鄭州450000)

血流感染可導致患兒出現高熱或寒戰等癥狀,主要由各種病原菌入侵血液并釋放毒素所致,屬于感染性疾病之一[1]。若血流感染患兒未能得到及時有效的治療,則可導致機體各器官功能發生損傷,并出現呼吸衰竭等不良情況,嚴重者可導致死亡。隨著激素及有創診療技術在臨床的廣泛應用,各種新型廣譜抗生素不斷更新,但兒童血流感染發病率及病死率仍未得到有效控制[2]。而兒童自身抵抗能力較低,故在細菌耐藥性較為嚴重的情況下,出現血流感染的概率較高。為此,臨床加強對致病微生物的檢測,對制訂治療方案和治療措施、降低患兒死亡率等具有重要意義。血培養是臨床最常使用的診斷方式,但存在檢測時間長、陽性率低等不足[3-4]。為探究一種更為有效的診斷方式,本次研究主要探討多重聚合酶鏈反應系統在兒童常見細菌及真菌血流感染的診斷效果。具體情況報道如下。

1 臨床資料

選擇2016年5月至2018年5月鄭州大學附屬兒童醫院收治的140例疑診血流感染患兒。其中男73例,女67例;年齡最小2個月,最大7歲,平均(4.32±3.20)歲;體溫＞38℃112例,體溫＜36℃28例。所選取對象均呈不同程度的高熱及寒戰癥狀;且其家屬均已簽署知情同意書。

2 檢測方法

2.1 檢測設備 檢測設備主要包括法國生物梅里埃VITK2 co mpact全自動微生物分析系統、Bac TALERT 3D120全自動培養儀、廣州健侖生物科技有限公司生產的QIAa mp Blood DNA Mini Kit及美國Gene Amp PCR Syate m 2720PCR反應程序。儀器操作步驟均按照儀器說明書等嚴格實施。

2.2 檢測方法 收集140例患兒外周靜脈血,并送至本院細菌室進行微生物培養及藥敏測驗;在采集與培養過程中均嚴格按照無菌操作及原則進行。采用全自動微生物分析系統鑒定與確認所選樣本;并采用全自動培養儀培養標本;采用QIAamp Blood DNA Mini Kit提取人類基因組DNA和對照菌株。特異性引物主要包括大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單細胞菌、尿腸球菌、肺炎克雷伯菌、鮑氏不動桿菌;聚合酶鏈反應體系：2.5μL 10×Buffer、2.0μL Mg Cl2(25 mmol/L)、2.5μL d NTP(2.5 mmol/L)、0.5μL引物(10μmol/L)、8.85μL dd H2O、2μL DNA 模板、0.15μL Taq酶(5 U/μL)組成;采用美國 Gene Amp PCR Syate m 2720PCR反應程序檢測多重聚合酶鏈反應。對照菌株及人類基因組DNA主要檢測多重聚合酶鏈反應系統特異性、DNA提取及聚合酶鏈反應。

3 療效觀察

3.1 觀察指標 分析多重聚合酶鏈反應系統在兒童常見細菌及真菌血流感染檢測中的特異性與敏感性。統計分析血培養法與多重聚合酶鏈反應系統檢測的陽性檢出率。

3.2 統計學方法 本次檢測結果均采用SPSS 20.0統計軟件計算與分析,計數資料以[例(%)]表示,采用χ2檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

3.3 結果

(1)多重聚合酶鏈反應系統檢測特異性與敏感性微生物經多重聚合酶鏈反應系統檢測后發現,金黃色葡萄球菌檢測下限值為103 CFU/mL。其他微生物如大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單細胞菌、肺炎克雷伯菌等均經DNA擴增后,呈單一條帶;其產物大小與檢測前預期結果符合度較高;其他微生物與人類基因組DNA無條帶生成。

(2)微生物檢查情況比較 在本次研究的140份標本中,血培養法檢測陽性標本共有16份(11.43%);多重聚合酶鏈反應系統檢測陽性標本共有30份(21.43%)。多重聚合酶鏈反應系統陽性率高于血培養法,差異有統計學意義(χ2＝5.10,P＝0.02＜0.05)。見表1。

表1 血培養法與多重聚合酶鏈反應系統微生物檢出比較

4 討論

血流感染屬于較為嚴重的感染性疾病之一,主要指各種病原菌及其他毒素入侵血流引起的臨床綜合征[5]。由于兒童機體抵抗力與免疫力相對較低,故血流感染發生率高于青年、中年或老年人群。本病發病過程中有炎癥介質的激活與釋放,而持續性血流感染則可導致患兒出現高熱、寒戰、呼吸急促、神志改變、皮疹、心動過速等臨床癥狀;且隨著病情的發展,還可導致患兒各器官功能衰竭,甚至導致其休克與死亡[6]。故明確兒童血液中細菌及真菌的種類,對制訂臨床治療方案、為血流感染提供流行病學信息等具有積極意義。

血培養法是臨床較為常見的檢測手段,將采集的血液注入血培養瓶,放入專業的血培養設備后,使其在適宜的溫濕度下進行孵育,繼而實施檢測;若檢測到細菌生長則會發出陽性報告[7]。血培養法雖然能提供一定的檢測數據,但由于血培養法培養時間長、陽性率低,故常無法滿足臨床診斷與治療的實際需求。有研究顯示,16Sr DNA-PCR在檢測兒童血流感染中具有較高的敏感性,且陽性檢測結果相對較高。但由于16S r DNAPCR檢測過程極易受到污染,故檢測結果出現假陽性的概率較高。在標本污染的前提下,外來微生物DNA則會放大擴增,繼而影響檢測的準確性。此外,由于16Sr DNA-PCR的檢測環境要求相對較高,故其應用范圍存在一定的局限性[8-9]。因此,應尋求一種方便、快速、準確、陽性率高的血流感染病原菌檢測方式。

多重聚合酶鏈反應系統是一種分子生物學技術,將其應用于兒童常見細菌及真菌血流感染的檢測,對指導感染性疾病的診療具有重要意義。多重聚合酶鏈反應系統在檢測過程中可放大與擴增病原菌核酸成分,分析與檢測病原菌遺傳學信息后,可得到較為準確的診斷結果[10]。故在上述結果中,140例患兒經血培養檢測后,其陽性率僅為11.43%;而多重聚合酶鏈反應系統陽性率檢測結果為21.43%,兩組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。由此可見,在兒童血流感染檢測中,多重聚合酶鏈反應系統敏感性高于血培養法。多重聚合酶鏈反應系統主要將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單細胞菌、尿腸球菌、肺炎克雷伯菌、鮑氏不動桿菌作為兒童血流感染的特異性引物,故可有效保障多重聚合酶鏈反應系統檢測的敏感性與特異性[11]。本研究中,以上7種兒童常見的血流感染微生物經多重聚合酶鏈反應系統檢測后,均顯示為單一且擴增的條帶,其區分度相對良好;在人類基因組DNA及其他微生物中,并無擴增條帶出現;同時金黃色葡萄球菌下限為103 CFU/mL。故可進一步說明多重聚合酶鏈反應系統在兒童血流感染的檢測中具有更高的敏感性與特異性。此外,多重聚合酶鏈反應系統對于檢測環境的要求相對較低,特異性引物不易被污染,故其檢測結果較為準確,可為臨床提供可靠的診治信息。需要注意的是,在采用多重聚合酶鏈反應系統檢測兒童血流感染過程中,需經過仔細的復核,保障與提高檢測結果的準確性。但多重聚合酶鏈反應系統仍存在一定的缺陷,因兒童常見病原菌譜常受到地區、人群、季節、氣候等方面的影響[12],故在實施多重聚合酶鏈反應系統檢測前,應對地區兒童血流感染等信息作相關調查,保障多重聚合酶鏈反應系統的檢測質量,診斷結果的準確性與有效性。

綜上所述,多重聚合酶鏈反應系統相較于血培養法,具有操作簡便、檢測消耗時間短、高特異性、高敏感性、污染風險小、成本費用低等優勢。故在兒童常見細菌及真菌血流感染的臨床診斷中,可將多重聚合酶鏈反應系統作為兒童血流感染的主要診斷方式,進而準確鑒定與分析兒童血流感染中常見的病原菌種類,為臨床治療兒童血流感染提供重要參考依據,提高臨床療效。