濃香型白酒地域性及窖泥微生物研究進展

梁 歡，許長峰，朱立寧，唐偉斌

（1.邢臺學院 生物科學與工程學院，河北 邢臺 054001；2.河北經貿大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊 050200；3.河北鳳來儀酒業有限公司，河北 寧晉 055550）

作為世界六大蒸餾酒之一，中國白酒以其獨一無二的風味著稱于世。其釀造的原料、工藝和環境的差異，造就了眾多的白酒香型。十二種常見香型中，濃香型憑借著超過七成的消費量和最廣闊的生產分布區域而成為了白酒中的佼佼者。泥窖發酵是濃香型白酒的基礎工藝，窖泥上多年富集的微生物種群產生了酒體的呈香物質。各地生產的濃香型白酒雖然工藝相近，但香味風格存異，皆因菌群使然。眾多濃香型白酒釀造企業的生存和發展與質量和特色休戚相關。地域性是與生俱來、無法復制的優勢。本文總結濃香型白酒風味特征的地域劃分，綜述窖泥品質、窖泥微生物研究現狀，以期為厘清菌群地域差別、培植地方小眾濃香型白酒的鄉土優勢、振興北方濃香型白酒提供參考。

1 濃香型白酒的地域性

與醬香型白酒茅臺的“一枝獨秀”相比，以五糧液、瀘州老窖、劍南春、洋河、古井等品牌為代表的濃香型白酒則可謂是“四處開花”。由于濃香型白酒具有香氣濃郁、醇甜濃厚、協調凈爽而深得民心，市場需求巨量，各地均有釀造生產。1992年，沈怡方[1]首提“四川”和“蘇、皖、魯、豫”兩個地域所產濃香型白酒的風味區別，并上升到流派高度。范廣璞等[2]論證了原料、工藝和地理環境不同導致主要微量香味成分差異，最終體現在酒體的特征上，將產于四川區域的濃香型白酒定義為“川派”，產于蘇魯皖豫地區的定義為“秦淮派”。李維青[3]認為不同地域的生態環境引發釀酒微生物區系不同，加之原輔料、工藝技術水平不同，所產濃香白酒風格存在微妙或較為明顯差異，明確指出濃香型白酒具有明顯的地域性，并進一步將濃香型白酒按生產地域分為“川、冀、江淮（黃淮）、北方……”。程偉等[4]劃分了白酒以流域為紐帶所形成的聚集產區，研究了江淮地區自然環境對柔和型白酒品質的影響，明確了其地域優勢。于春濤等[5]研究證明濃香型白酒窖泥中細菌多樣性與其產區之間存在一定聯系。

大量研究表明，濃香型白酒具有明顯的地域性，正所謂“一方水土釀一方酒”。三分天下之論與所對應的群山合圍的四川盆地、蜿蜒起伏的秦淮丘陵山崗、地勢平坦的北方平原地帶，以及涇渭分明的氣候、生態環境特征相吻合。雖然地域差異決定的原料、氣候環境、菌群資源的各異，又導致濃香型白酒酒體風味的奇妙迥異，目前的地域性研究卻有著粗獷、簡單之嫌。

2 濃香型白酒釀酒窖泥質量的研究

泥窖實為濃香型白酒的魂魄。泥窖發酵是濃香白酒最重要的工藝環節之一。濃香型白酒香味形成與窖池息息相關，窖泥是酒體生香功能微生物的繁殖容器及載體。不同品牌都有自己獨有的窖泥來源，這也是濃香白酒地域性的重要表現。五糧液使用宜賓獨特的弱酸性黃泥黏土，瀘州老窖的窖泥采用瀘州附近五渡溪出產的細膩黃黏土，冀酒泥坑采用的則是河北寧晉黑龍港流域獨有之狗頭膠泥……總的來看，各種濃香酒的窖泥大多為膠黏土，分布于主產區及周邊。窖泥的黏性既滿足了保水不透氣的要求，又達到了附著在窖壁的效果。其原泥不僅含有氮、磷、鉀、鈣、鐵、鎂等成分，且隨著使用時間的增加，各元素還會在部位、種類、含量等水平發生變化[6]，表現出窖泥的優劣和老熟程度。何宏魁等[7]采用常規分析檢測技術測定窖泥pH值和腐殖酸含量，研究其與細菌含量的相關性，推斷這兩項指標可用于衡量窖泥微生物數量的理化指標。

對窖泥質量的評價研究，主要集中在窖泥對菌群的富集能力和對功能菌的時空篩選馴化。“酒好全憑窖池老”，優質老熟的窖泥對酒質的提高與穩定至關重要[6]。由于不同酒企采用窖泥的獨特性，以及生產過程參數控制的不同，導致其理化指標差異較大，需要建立企業級窖泥質量標準和窖泥保養技術規范。

3 濃香型白酒窖泥微生物的研究方法與技術

濃香型白酒釀造過程的實質是分別來自于環境、曲藥和窖泥的微生物，在窖池內酒醅中發生的固、液、氣三維空間的物質能量代謝過程。窖泥中棲息著極其豐富的微生物區系。窖泥微生物的協同發酵為酒體香味物質的形成和轉化提供反應底物，進而奠定了濃香型白酒濃郁復合香氣的風味特征基礎。

3.1 窖泥微生物研究方法

包括分離、純化、培養、鏡檢、理化性質測定等環節在內的傳統微生物研究方法，目前依然是研究釀酒窖泥微生物不可或缺的成熟技術，主要用于菌類的種類鑒定。由于自然界中只有0.1%～10%的微生物可以被直接培養[8]，大多數窖泥微生物難以利用傳統方法培養和研究。20世紀90年代，源自分子生物學研究領域的變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、催化報告沉積-熒光原位雜交（catalyzed reporter deposition-fluorescence in situ hybridization，CARD-FISH）、磷脂脂肪酸（phosphor lipid fatty acid，PLFA）指紋圖譜等技術已經在釀酒微生物研究領域得到廣泛應用。這些方法跳過分離培養環節，可通過直接檢測樣品中細菌總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）而確定窖泥微生物種類及豐度，避免了傳統微生物研究的局限性。近年來一經推出就被快速推廣的高通量DNA測序技術——Illumina Solexa 合成測序，憑借對以百萬計的原位DNA樣品分析產生遺傳信息，來同時分析樣本內菌群豐度和樣本間菌群豐度差異。該技術能深度測序，大規模、高通量、短耗時，尤適分析復雜多菌種樣品，在生物、醫學、土壤、食品等領域研究中被廣泛應用。在釀酒行業，高通量程序技術已經應用于醬香、清香、濃香等香型的窖泥、大曲、酒醅、糙沙微生物群落的研究[9-13]。

3.2 釀酒微生物研究技術的應用

白酒為中國特產。國外對白酒的研究目光主要集中在釀酒菌類的培養技術和分離鑒定技術的改進方面。濃香型白酒發酵中產香己酸菌的研究起始于20世紀40年代。MUYZER G等[14]將DGGE技術應用于微生態學研究領域，證實了此技術在解釋生物遺傳多樣性和種群多樣性差異方面的獨特優勢。迄今為止微生物鑒定系統中最大的數據庫資源當屬美國MIDI公司20世紀90年代研發出來的Sherlock MIS微生物自動鑒定系統[15]。ENDO A等[16]利用PCR-DGGE法檢測到了常規細菌檢測方法沒有檢測出的韓國燒酒釀造過程中含有的乳酸菌群。MADOROBA E等[17]采用DGGE法和常規分離方法對南非高粱自然發酵過程中細菌種群的多樣性和動態變化進行了跟蹤分析，認為這兩種技術的結合使用對揭示微生物的多樣性至關重要。FISH和CARDFISH均被用于改進土壤微生物的檢測[18]，CARD-FISH相對更適合用于圖像分析研究。

國內對濃香型白酒微生物的研究起步晚，但發展迅速。傳統的微生物分離分類鑒定技術在篩選、培養菌株[19]研究方面有所長，但揭示釀酒微生物的多樣性則為短板。劉茂柯等[20-22]用變性梯度凝膠電泳分析窖泥放線菌和復合功能菌液群落結構，魏娜等[22]的實驗證明實時熒光定量PCR技術可用于窖泥微生物區系特定種群的快速定量檢測。具有準確地表征、預測微生物群落結構優勢的高通量測序技術一經問世即被廣泛應用。李俊輝等[23-24]采用高通量測序技術分別分析研究了窖泥樣品中微生物與古菌群的群落結構。五糧液[25]、瀘州老窖[26]、古井貢[27]、宋河糧液[28]、古襄陽[29]等酒企分別利用高通量測序技術對窖池中窖泥的微生物群落進行了不同程度的解析。而利用傳統培養技術與現代高通量測序技術結合方法，韓穎[30]分離鑒定了窖泥中微生物群落，進行了宏基因組測序。

4 窖泥微生物的種類組成與種群結構研究

研究窖泥微生物的種類組成與群落結構，對于揭示白酒釀造風味機理、提質增香具有相當重要的作用。1964年，茅臺試點首次發現濃香型白酒主體香氣物質是己酸乙酯，并成功地從窖泥中分離出與甲烷短桿菌共棲的鼓槌狀芽孢桿菌，經一系列形態觀察及生理生化鑒定，確定了所分離的是己酸菌[31]。不完全統計，從窖泥中分離鑒定的釀酒功能菌已近百株。白酒品質與這些微生物復雜的代謝活動及代謝產物息息相關，其中己酸菌的主要代謝產物己酸乙酯是濃香型白酒酒體香味的主體[32]的論斷已經成為共識。

綜合學者研究結果，窖泥微生物類群包含有細菌、霉菌、酵母菌、古生菌和放線菌等，大多數為細菌和古生菌。細菌從科水平而論，主要由鹽扁菌科（Haloplasmatacea）、芽孢桿菌科（Bacillaceae）、球菌科（Planococcaceae）、互營單胞菌科（Synergistaceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）、嗜熱厭氧菌科（Thermoanaerbacteraceae）、梭菌科（Clostridiaceae）等組成。不同地域的窖泥中古生菌菌落趨于一致，主要由甲烷桿菌綱（Methanobacteria）的甲烷桿菌科（Methanobac teriaceae）和甲烷球菌綱（Methanococci），與熱源體綱（Thermoplasmata）的熱原體科（Thermoplasmataceae）構成[33-34]。王春艷等[28]比較了濃香型白酒16年窖齡窖泥中細菌群落結構，絕對優勢屬為梭菌屬（Clostridium）、氨基酸桿菌屬（Aminobacterium）、理研菌屬（Petrimonas）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）和消化鏈球菌屬（Sedimentibacter）。劉燕梅等[35]從濃香型白酒窖泥中篩選出對濃香型風味的形成起著放香、助香及調香作用的球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaerieus）、短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）、塵埃類芽孢桿菌（Paenibacillus larvaesubsup.pulvifaciens）。趙輝等[36]對兼性厭氧細菌高產己酸菌進行分離得到3株菌—巨大芽孢桿菌（B.megaterium）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和梭狀芽孢桿菌（B.fusiformis）。黃治國等[37]分離純化得到5株細菌，分別為微球菌屬（Mierococcus）、水稻細菌性古枯病菌屬（Burkholderiaglumae）、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬（Staphylococeus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）。甚至周艷等[38]對25年窖齡窖泥中的1株產丁酸菌株進行了多相分類學研究，經分析發現該菌可能為毛螺旋菌科的一個新屬。張志偉等[39]在窖泥微生物的研究中發現不同年份窖泥中優勢菌種差別較大，窖泥不同高度優勢菌種也大有不同。羅杰等[40]研究發現，窖池中壁泥和底泥細菌種類及數量的差異性較大，認為其細菌系統發育多樣性及相互之間存在差異。李紹亮等[41]研究認為，就總數而言，窖泥中細菌、放線菌、酵母菌和芽孢桿菌隨著窖池窖齡的增加而增加，霉菌的變化較小；同窖齡窖泥，池底細菌高于池壁，池壁的放線菌和酵母菌高于池底。窖池所產原酒質量隨窖齡的增加明顯提升。

5 結論與展望

總結目前濃香型白酒窖泥微生物的研究現狀，以下幾個特點是顯而易見的。一是在窖泥微生物種類數量研究領域，傳統的分離培養技術仍在發揮著重要作用。人們熱衷于篩選鑒定影響酒體風味的關鍵菌，并對其分離、培養、擴繁，以功能菌復合菌制劑形式再返施窖泥，進行窖泥的培熟、養護，以及變質窖泥的處理[42]。這一技術還將繼續使用并發展改進。但存在的問題是，大型酒企憑借雄厚的實力起步較早，一些中小酒企則相對落后。企業依靠直接從科研院所和大酒企購買功能菌制劑用于生產，易產生水土不服現象，降低效果。二是在窖泥菌群交替演化規律，以及環境、時空變化與菌群性質功能的關系上，隨著現代研究技術的應用，規律與關系日漸清晰，從微生態到車間環境，引導、改善釀造體系向著提質降耗方向轉移成為了可能。同樣，知名酒企大眾品牌在這方面也走在前列。從而引出第三個方面，濃香型白酒的地域特性被掩蓋，發展不平衡。特別是北派濃香酒，地域廣，產區分散，大部分經濟不發達，科技支撐度低，使得憑借獨特的歷史文化、地理氣候、工藝技藝而流傳繼承至今的地方品牌發展舉步維艱。

發展濃香型白酒產業，重點在“香”，方向在“特”。在保持目前川派、秦淮派發展勢頭的前提下，做大做強北派濃香。一方面加強理念引導，凝練特色，借力川派的醇冽、秦淮的綿柔來打造北派的凈雅。二是保護遺產與資源，充分利用歷史文化和自然資源，天人合一、水土共釀，讓遼闊、粗獷和四季融入酒體，突出地域特色。三是科技賦能，摸清底數，采用新技術提質增香降耗，傳承提升老工藝，創新釀酒新技藝，讓小眾酒走向大市場。