多重聚合酶鏈反應(yīng)在α-地中海貧血診斷中的應(yīng)用價值

張應(yīng)聯(lián)，蔡小芳

廈門大學附屬婦女兒童醫(yī)院·廈門市婦幼保健院 (福建廈門 361001)

α-地中海貧血是一種以溶血性貧血為主要特征的單基因隱形遺傳疾病，主要因α-珠蛋白基因的大片段缺失所致，在遺傳學上具有較高的異質(zhì)性，嚴重危害患者的生命健康。因此，臨床上早期有效篩查α-地中海貧血，以進行早期對癥處理意義重大[1]。目前，應(yīng)用于α-地中海貧血檢測的方法較多，包括血液檢查、高效液相色譜法、毛細管電泳法及多重聚合酶鏈反應(yīng)等，其中血常規(guī)檢查雖能夠進行篩查，但在紅細胞基因具體分型中具有一定局限性；高效液相色譜法檢測操作復雜、費用高，因此臨床推廣受到限制；而多重聚合酶鏈反應(yīng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于α-地中海貧血基因診斷中，且可對α-地中海貧血進行準確分型[2-3]。本研究旨在探討多重聚合酶鏈反應(yīng)在α-地中海貧血診斷中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年5月至2019年3月在我院出生的684例新生兒作為研究對象，所有新生兒均接受毛細管電泳法及多重聚合酶鏈反應(yīng)檢查。排除標準：孕母異常分娩及出現(xiàn)妊娠高血壓；產(chǎn)前7 d內(nèi)孕母血紅蛋白水平<60 g/L；新生兒出現(xiàn)宮內(nèi)缺氧及遺傳性代謝性疾病；新生兒消化道出血；新生兒血型不合溶血。

1.2 方法

1.2.1毛細管電泳法檢測

在新生兒順利娩出，剪斷臍帶后，抽吸2 ml臍帶血，抗凝后進行離心處理，3 000 r/min，離心3 min；取紅細胞層樣本18 μl置入90 μl溶血素稀釋杯中，待測；采用法國Sebia公司生產(chǎn)的CapiLLarys2全自動毛細管電泳儀及相關(guān)配套試劑盒進行檢測，檢測過程中需嚴格遵照說明書操作，檢測電壓為9.8 kV，檢測波長為145 nm，且需在堿性緩沖溶液前提下實施血紅蛋白電泳，并詳細記錄該條件下各種血紅蛋白百分比，且進行定量測定。

1.2.2多重聚合酶鏈反應(yīng)

采用經(jīng)典的酚-氯仿抽提法于待測靜脈血中提取樣品中的DNA；檢測過程中使用的α-地中海貧血基因診斷試劑盒由深圳益生堂生物企業(yè)公司提供，需嚴格按照相關(guān)說明書操作，其中25 μl反應(yīng)總體積中含有基因組DNA 0.1～1.0 μg，2.5 U Taq DNA酶；聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95 ℃變性5 min，97 ℃變性45 s，61 ℃退火1 min 30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；取每管中聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物10 μl，并將2 μl電泳加樣緩沖液加入管內(nèi)，混合均勻，將混合產(chǎn)物加入1.0%瓊脂糖凝膠加樣孔中，保持溫壓進行約15 min的電泳后，置于UVP或VU燈下進行觀察；聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物在經(jīng)過純化后，采用MegaBACE1000型全自動毛細管測序儀測序。

1.3 臨床評價

比較毛細管電泳法檢測與多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測的結(jié)果。電泳譜圖根據(jù)不同血紅蛋白分為15個區(qū)域，其中HbH=Z15，HbBart=Z12，HbF=Z7，HbA=Z9，HbA2=Z3，判定標準：正常，HbBart為0；靜止型，HbBart為0.1%～1.5%；標準型，HbBart為1.6%～6.0%；中間型，HbBart為6.1%～40.0%；重型，HbBart為40.1%～90.0%。多重聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果判定：根據(jù)深圳益生堂生物企業(yè)公司生產(chǎn)的α-地中海貧血基因診斷試劑盒進行分型診斷[4]。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 毛細管電泳法檢測與多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測結(jié)果

毛細管電泳法檢測684例新生兒共篩選出α-地中海貧血陽性標本76例(11.11%)，多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測684例新生兒共篩選出α-地中海貧血陽性標本101例(14.77%)，多重聚合酶鏈反應(yīng)陽性檢出率高于毛細血管電泳法，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.056，P=0.044)，見表1。

表1 毛細管電泳法檢測與多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測結(jié)果[例(%)]

2.2 不同分型新生兒血液HbA及HbBart水平比較

不同基因分型α-地中海貧血患兒HbA及HbBart比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同分型新生兒血液HbA及HbBart水平比較

3 討論

地中海貧血的發(fā)生可能為編碼珠蛋白基因發(fā)生突變，使珠蛋白合成出現(xiàn)障礙，血紅蛋白組分發(fā)生改變，常使患者出現(xiàn)不同程度的貧血癥狀，嚴重影響患者的身心健康。我國是α-地中海貧血高發(fā)國家，且目前臨床針對該病尚無較為有效的治療方案，因此，做好疾病的篩查工作，早期進行預防仍是臨床研究的熱點[5]，而選擇適宜的檢測方法以進行早期篩查尤為重要。

多重聚合酶鏈反應(yīng)是在單一反應(yīng)中同時加入數(shù)對引物以擴增出多個序列，且因多重聚合酶鏈反應(yīng)的特異性，主要取決于模板與引物之間的相似性，隨著引物對數(shù)的不斷增加，導致得到錯配引物的風險更大，因此在進行多重聚合酶鏈反應(yīng)過程中，正確選擇適宜的引物是檢測的關(guān)鍵，且多重聚合酶鏈反應(yīng)與經(jīng)典的α-地中海貧血聚合酶鏈反應(yīng)相比，其可減少檢查重復次數(shù)，操作相對更加簡單，可節(jié)省檢測時間[6]。本研究結(jié)果顯示，不同基因分型α-地中海貧血患兒HbA及HbBart存在一定差異性，且正常型基因型中HbA水平>靜止型>標準型>中間型>重型，正常型HbBart水平<靜止型<標準型<中間型<重型，因此臨床中可根據(jù)貧血患者HbA及HbBart差異性進行分型評估。地中海貧血患兒HbA水平會隨著病情嚴重程度增加而不斷降低，且因患兒機體內(nèi)β-珠蛋白可降低HbA水平，因此HbA水平與病情成負相關(guān)。靜止型地中海貧血中存在1個α-基因的缺失，故另一個α-基因代償功能會不斷增強，但在新生兒出生后HbBart水平會迅速下降，但患者病情越嚴重，機體內(nèi)的γ珠蛋白鏈合成量會不斷增加，促進HbBart的形成，因此HbBart水平與α-地中海貧血病情嚴重程度成正相關(guān)。

綜上所述，與毛細管電泳法相比，多重聚合酶鏈反應(yīng)具有準確性高、快速等優(yōu)點，可用于臨床α-地中海貧血的篩查。