馬齒莧調節人肝癌細胞肺轉移裸鼠的血液代謝組學分析

林玩福， 張夏炎， 呂狄亞， 趙沙沙， 曹靜文，郁沙莎 ， 程彬彬 ， 翟笑楓 ， 鄭國銀

1.第二軍醫大學中醫系，上海 楊浦 200433；2.上海長海醫院，上海 楊浦 200433；3.海軍軍醫大學，上海 楊浦 200433

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，臨床上具有預后兇險、病死率高等特點。目前，肝癌治療方式眾多，以肝切除術為代表的外科治療仍是肝癌的首選治療方法，而單一外科手術治療已到平臺期，資料顯示2012年至2015年中國肝癌的五年生存率僅為12.1%。以靶向治療為代表的肝癌藥物治療手段是目前的熱點，在晚期肝細胞癌靶向二線治療研究中，布尼尼布、依維莫司、雷莫盧單抗均針對索拉非尼治療失敗后的肝細胞癌進行了研究，但是它們的中位總生存期（Overall Survival，OS）并沒有達標。2017年4月，美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）已經批準瑞戈非尼在治療后進展的肝細胞癌患者試驗，截至2018年1月14日，瑞戈非尼將中位OS改善至10.7個月（95%CI：9.1～12.2），而安慰劑組為7.9個月（95%CI：6.4～9.0），死亡風險減少了38%（HR=0.62；95%CI：0.51～ 0.75；P ＜ 0.0001），從試驗中看到的OS延長時間并不是很明顯[1]。肝癌的新藥研究一直面臨困局，中醫藥作為我國的傳統醫學，在肝癌的治療全過程中一直發揮了重要的作用。

馬齒莧為馬齒莧科馬齒莧屬植物，廣布全球溫帶和熱帶地區，喜歡溫暖潮濕的環境，在城市和農村地區都能見到，對土壤、濕度、溫度、蟲害等環境的要求不高，容易栽培存活且適應性極強，其為常用的藥食兩用植物，也是有名的“救荒本草”。馬齒莧地上部分入藥，其味酸、性寒，具有清熱解毒、涼血消腫之功效。在前期工作基礎中，我們發現馬齒莧有效成分有多糖、生物堿、總多酚、多不飽和脂肪酸和黃酮等[2-5]，我們對馬齒莧提取物的抗肝癌活性成分進行初步篩選，并同時觀察到馬齒莧提取物在體外有抗肝癌細胞增殖和轉移的作用。然而馬齒莧的體內抗肝癌效果未知，為探究其體內發揮抗腫瘤作用的有效物質、代謝途徑和作用機制，我們通過構建人肝癌細胞肺轉移裸鼠模型，來觀察馬齒莧在體內抗肝癌轉移的療效及其代謝過程[6-9]。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑和儀器

光學顯微鏡（日本Olympus公司），電子天平（德國Sartorius公司），全自動組織脫水浸蠟機（日本Tepsarvra公司），2035型切片機（德國Leica公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備儀器廠），二氧化碳孵箱（德國Heraeus公司），ZMN-6803型自動溫度控制漂片烤片儀（西安華利電子公司），ZH-3型石蠟切片用冷臺（沈陽綜縱橫高技術公司），IMS圖像分析軟件（上海申騰信息技術有限公司），TSE型電熱保溫干燥箱（日本SNAYO公司），脫色搖床（武漢Servicebio），HPLC甲醇（德國Merck公司），乙腈（德國Merck Dannstadt公司），甲酸（美國Sigma-Aldrich公司），L-2-氯-苯丙氨酸（美國Sigma-Aldrich公司），蒸餾水（屈臣氏），低溫離心機（美國Thermo fisher FRESCO17公司），其它試劑均為市售分析純。

1.2 馬齒莧制備

馬齒莧配方顆粒，購于江陰天江藥業有限公司，代號：1203031，依據中國藥典2015年標準、江陰天江藥業有限公司內校質量標準，取樣GZSOP0ZE405中藥配方顆粒取樣操作流程符合質量規定。按照濃縮顆粒：生藥為1∶10的比例溫水調制成需要的藥物濃度，高濃度2 g/ml、低濃度1 g/ml。

1.3 細胞培養

人肝癌細系Huh 7-luc由海軍軍醫大學附屬長海醫院中醫科實驗室傳代保存，實驗開始前進行復蘇。復蘇后用含10%FBS的完全培養基，在37℃、體積分數為5%CO2、完全飽和濕度條件下常規培養，培養過程中視細胞的生長狀態進行換液，并在細胞達到對數生長期、融合度為80%～90%時進行消化傳代或鋪板。消化過程中，先將原培養基吸除，用PBS洗滌3次，然后將PBS吸除干凈后加入適量含0.25%胰蛋白酶/EDTA進行消化，消化過程放恒溫培養箱視消化程度計時12 min，待細胞成接近泥沙樣下滑時即為消化完全，取出加入完全培養基終止消化，用移液槍輕輕吹打均勻后，按照一定比例進行傳代，或者計數后進行鋪板。

1.4 實驗動物

本實驗采用的研究動物為BALB/C雄性裸鼠，4周齡，體重約18～20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物合格證編號為2016-0006。裸鼠飼養于第二軍醫大學第一附屬長海醫院中心實驗室動物房，SPF級環境，飼料來源于斯萊克公司所用繁殖飼料，通過輻照滅菌，飲用水為高壓高溫滅菌純凈水，墊料及籠具均由中心實驗室動物房提供，高溫高壓滅菌，所有實驗裸鼠均自由采食和飲水[10]。

2 實驗方法

2.1 裸鼠肺轉移瘤模型建立

選擇Huh 7-luc細胞，取處于對數生長期、狀態良好的細胞進行常規消化，消化后細胞在離心機離心5 min，后將上清培養基移除，加入PBS重懸細胞，用移液槍輕輕將細胞吹打成單細胞懸液，細胞計數并定量至8×106個/mL，置于冰上備用。取本課題組研制的裸鼠尾靜脈注射裝置，先將水浴鍋預熱42℃并保持恒溫，固定好裸鼠后將其尾部放入溫水中5 min，促使尾靜脈擴張，取出后找到兩側擴張明顯的靜脈，取出胰島注射用1 mL注射器，吸取200細胞懸液，使針頭與尾靜脈方向平行，然后進針，有突破懸空感后將細胞注入尾靜脈，正確注射進尾靜脈應較順暢無抵觸感，退針后用棉球按壓針孔止血。

本次造模共24只裸鼠，分為3組，每組8只，分別為對照組、馬齒莧高劑量組（10 g/ml）、馬齒莧低劑量組（5 g/ml），藥物濃度參考本實驗先前馬齒莧相關實驗的結果[7-8]。接種后第7天開始按照分組進行干預，取出配制好的馬齒莧溶液，預熱至37℃搖勻，取出進行灌胃，每只灌400 μL溶液，對照組灌等體積的無菌生理鹽水，加藥干預共4周，然后處死取材。眼眶取血，脫臼處死裸鼠，稱小鼠體重，剝取肺組織，Bouins液染色24小時后，75%酒精固定，肉眼計數肺轉移的結節數目，同時對肺轉移病灶進行HE染色、包埋肺組織，制成蠟塊，HE染色，鏡下復核計算結節數目，觀察不同組肺內組織的情況。肉眼所見肺轉移的結節呈現半透明樣，切開呈實性，染色所見轉移灶細胞腺樣排列，細胞呈圓形、橢圓形或者不規則形，分化差，核大，深染，核質比大，細胞核分裂相多見。計算轉移抑制率=1-（治療組轉移率/對照組轉移率）×100%。

2.2 樣本前處理

取200 μL血，加入含內標（5 ug/mL，L-2-氯-苯丙氨酸）的溶劑（甲醇∶水=8∶2）0.6 mL，低溫離心，12 000 rpm，4℃，離心10 min，取200 uL上清液置進樣小瓶，進行代謝組學分析。取等量的各待測樣本混合，作為質量控制（Quality Control，QC）樣本。

2.3 LC/MS分析

LC-MS分析使用Agilent6538UHDandAccurate-Mass Q-TOF質譜聯用儀與Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜。色譜柱選用Waters ACQUITY UPLC@HSS T3（2.5 μm，100 × 2.1 mm）進行分析。

流動相：A-0.1%甲酸溶液，B-乙腈（0.1%甲酸）；流速：0.4 ml/min；柱溫：25℃；Post Time：5 min；進樣量：3 μL。優化的色譜梯度：0～2 min，5%B；2～13 min，5～95%B；13～15 min，95%B。Post time設為5min，用于平衡系統。

質譜使用正離子模式結合負離子模式，優化后具體的參數如下：capillary voltage，4 kV in positive mode and 3.5 kV in negative mode；drying gas flow，11l/min；gastemperature，3501C；nebulizerpressure，45 psig；fragmentor voltage，120 V；skimmer voltage，60 V。質譜的采集范圍m/z 100～1 000。在實驗室質譜采集的過程中同時打入參比離子用于監測質量軸的準確性，其中正離子模式參數為：121.050 9，922.009 8；負離子模式參數為：119.036 3，966.000 7。

2.4 統計學分析

使用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.04.00 software（美國安捷倫技術，公司）將原始數據轉換成通用的格式mz.data進行分析。在R軟件平臺下，使用XCMS程序包進行峰的識別，同時保留時間校正，進行自動積分的預處理。同時進行內標歸一化以及重量歸一化，得到一個包含樣品名，m/z-RT對，峰面積的可視化矩陣。將編輯后的數據矩陣導入Simca-P軟件（版本11.0），進行中心化和Pareto標度化后，進行多元統計分析處理。采用PLS-DA模型的S-Plot來反映不同組別的離子對組間差異的貢獻程度，采用PLS-DA模型的VIP（Variable Importance in the Projection）值，如果VIP＞1則被認為是潛在的差異代謝物。對VIP＞1的值進行獨立樣本T檢驗分析，其中P＜0.05的代謝物則被認為是有差異的代謝物。

3 實驗結果

3.1 馬齒莧對裸鼠肺轉移瘤模型的影響

如表1所示，從不同組別的實驗性肺轉移瘤小鼠肺轉移瘤數目上可得，空白對照組轉移數為6.86±2.54、低劑量組轉移數為4.75±1.91、高劑量組轉移數為3.14±1.57，馬齒莧高劑量組（G）和馬齒莧低劑量組（D）的肺轉移數目明顯低于正常對照組（P均＜0.05）；且馬齒莧高劑量組抑制率為54.16%，馬齒莧低劑量組抑制率為30.72%，提示馬齒莧能抑制肝癌的肺轉移；如圖1和表1所示可見馬齒莧用藥組與空白對照組相比，其腫瘤數目及大小明顯下降；而三組的裸鼠體重上差異沒有統計學意義。

圖1 馬齒莧干預后的肝癌肺轉移模型裸鼠的肺組織Figure 1 Lung of nude mouse with lung metastasis model of liver cancer after purslane treatment

表1 實驗性肺轉移瘤小鼠的肺轉移情況表Table 1 The number of lung cancer in nude mouse with experimental pulmonary metastasis liver cancer

3.2 血液樣品圖譜分析

圖2為血液樣本的離子色譜圖，其中A為正離子模式下典型的總離子流圖，B為正離子模式下典型的總離子流圖。從圖中可看出正模式下共得到1342個features，負離子模式下共得到409個features，正負離子出現不同的峰值。

3.3 多元統計分析

我們采用PCA建模方法對QC樣本的聚集程度進行考察，如圖3示，正（2A）、負（2B）離子模式下QC樣本均聚集良好，其離散度明顯低于待分析樣本的離散度，表明系統穩定性良好。圖3示高劑量組、低劑量組和模型組的樣本分布分離趨勢明顯，高劑量組、低劑量組以及空白組的樣本分布在不同的區間，提示給藥組和對照組之間，以及高、低劑量組之間在代謝產物上存在分離趨勢。

從多元統計方法偏最小二乘判別分析（PLSDA）對給藥組與模型組樣本（如圖4示）進行分析。發現正離子（A）、負離子（B）模式下得分圖的不同組之間呈現出明顯的分離趨勢。判別模型質量好壞的主要參數為R2Y（該值代表模型的解釋率）及Q2值（該值為模型的預測率）。另外我們還對模型進行排序驗證，檢驗模型是否“過擬合”。模型對于解釋兩組之間差異及尋找差異物質是可靠的，且從排序驗證圖得模型不存在“過擬合”現象，即可利用此數據進行后續分析。模型是否存在“過擬合”體現了模型的構建是否準確，未“過擬合”則說明模型能較好地描述樣本，并可作為尋找模型生物標記物群的前提；“過擬合”則說明該模型不適用于描述樣本，且此數據不宜做后續分析。而本樣本的正離子模式下累積R2X=0.7，R2Y=0.921，Q2=0.701；負離子模式累積R2X=0.926，R2Y=0.99，Q2=0.954，說明不同組別的代謝產物的分離明顯。同時對模型進行排列測試，如正離子（C）、負離子（D）所示，從檢驗模型我們可看出模型不存在“過擬合”的現象。

圖2 典型總離子流色譜圖（TIC）。A為正離子模式下高劑量總離子流圖，B為負離子模式下總離子流圖Figure 2 The Total Ion Chromatogram of QC（TIC）：（A）ESI+，（B）ESI-

圖3 樣本及QC樣品的PCA得分圖Figure 3 The PCA scores plot of all samples：（A）ESI+，（B）ESI-

圖4 測試組的PLS-DA模型圖得分和排列測試圖。A為PLS-DA得分圖（pos），B為PLS-DA模型的排列測試圖（pos），C為PLS-DA得分圖（neg），D為PLS-DA模型的排列測試圖（neg）Figure 4 The PLS-DA model score and permutation test chart of all samples：（A、C）ESI+，（B、D）ESI-

3.4 差異物質篩選與鑒定

為了進一步說明馬齒莧對肝癌肺轉移裸鼠血液的影響，研究采用PLS-DA模型的S-Plot來反映不同組別的離子對組間差異的貢獻程度，從圖5中可看出，離原點越遠的點表明其對組間差異的貢獻度越大，其VIP值也越大。其中差異性代謝物的定性方法為：通過搜索在線數據庫（Metlin、HMDB等）進行精確分子量的比對，同時通過MS/MS譜圖的比對以發現代謝產物名稱。如表2所示我們發現人肝癌肺轉移裸鼠的差異代謝物有六十余種，其中主要包括有尿素、三甲基乙烯胺、絲氨酸、煙酰胺、肉堿、苯丙氨酸、丙醇、尿酸、色氨酸、乙?；鈮A、1，2-二苯乙烷-1，2-二醇、丙?？嵬?、辛基酰膽堿脫羰基、異丁酰左旋肉堿、棕櫚酸、高香草醛硫酸、丙酮、左旋棕櫚酰肉堿、左旋肉堿、依萊迪肉堿、4-β-羥甲基-4-α-甲基-5-α-膽固醇-7-烯-3-β-醇、牛磺膽酸鹽、2-亞麻酰-甘油-3-磷酸膽堿、2-油酰甘油磷酸膽堿、2-花生四烯酸甘油磷酸膽堿等物質，這類代謝產物覆蓋范圍較廣，其中通路歸屬主要集中為脂肪酸、氨基酸、能量代謝等相關物質。

圖5 馬齒莧對肝癌肺轉移裸鼠的PLS-DA模型的S-Plot分析。A為正離子、B為負離子Figure 5 The PLS-DA scores plot of all samples：（A、C）ESI+，（B、D）ESI-

表2 馬齒莧對肝癌肺轉移裸鼠作用的差異表達代謝物列表Table 2 The list of different expression metabolites of nude mouse with lung metastasis model of liver cancer after purslane treatment

（續表2）

4 討論

肝癌起病隱匿，惡性程度高，手術是最佳的治療選擇，但術后5年生存率僅為30～50%，復發轉移率超過60%，現有的藥物并不能有效控制手術后的疾病進展，因此探尋有效的診斷標志物和藥物干預仍然是目前的研究者需要努力的方向。

代謝組學自問世以來，不斷發展更新，目前被廣泛應用到臨床和基礎研究的各個領域中。在肝癌研究中，相比于基因組學與蛋白組學等其他組學技術，代謝組學展現出它獨到的優勢，代謝組學能反映肝癌體內基因水平、蛋白質水平各因素綜合作用下的最終結果，各種微小變化都可能引起代謝物中的差異出現，產生大量異乎尋常的代謝物，因此能夠更綜合、更準確、更靈敏地反映肝癌肺轉移裸鼠的生物體系的狀態[11]。

在肝癌代謝組學方面，目前的報道主要集中在肝癌患者領域，比如Yin等[12]利用液質聯用技術（LC/MS）對乙肝誘導的肝硬化患者與HCC患者的血清進行代謝組學研究。通過反向液相色譜與親水作用色譜兩種方式獲取了25例健康志愿者、24例肝硬化患者與25例HCC患者的血清數據，經過化學計量學標準化和整合的數據用OPLS分析，篩選出了潛在的生物標志物。其中甘氨膽酸，甘氨鵝去氧膽酸，牛磺膽酸以及牛磺鵝去氧膽酸是肝硬化的潛在生物標志物，二氫鞘氨醇與4-羥雙氫鞘氨醇是肝癌的潛在標志物。

Gao等[13]利用NMR對肝硬化與HCC患者的血清進行了代謝組學研究。選擇了63例健康志愿者、36例肝硬化患者與39例HCC患者，發現與健康人相比，肝硬化與HCC患者的血清中含有更高的醋酸鹽、N-乙酰糖類蛋白、丙酮酸、谷氨酰胺、a-酮戊二酸鹽、甘油、酪氨酸、1-甲基組氨酸與苯丙氨酸，以及更低的脂蛋白、異亮氨酸、纈氨酸、乙酰乙酸、肌酸、膽堿與不飽和脂類等物質。

對于肝癌動物模型的代謝組學分析目前鮮有報道，本項目采用LC/MS儀器對小鼠血清樣本進行檢測。對所有樣本中這些物質的峰的響應強度數據進行模型判別分析，我們首先使用SIMCA-P了軟件對樣品進行了PCA分析，隨后進行PLSDA、OPLS-DA的模型構建，最終獲得了差異性表達代謝物。差異物質種類主要包括氨基酸類、脂肪酸類、有機酸類等。主要影響的通路有氨基酸代謝、脂肪酸代謝、脂質代謝等。

本次實驗結果提示馬齒莧能夠抑制裸鼠肝癌肺轉移模型的腫瘤轉移，同時對裸鼠的體內代謝產生一定的影響，隨著藥物濃度的不同，其抑制腫瘤轉移和體內代謝產物方面也不同。這一方面說明代謝組學對裸鼠體內代謝物質的檢測的靈敏度較高，同時提示馬齒莧能夠抑制肝癌肺轉移的發生，可能在一定程度上與干擾裸鼠的體內代謝有關。在肝癌發生發展過程中，癌組織畸形的能量需求及正常組織功能的受損及紊亂可同時表現于血液中。有研究證實肝癌及癌旁組織間脂酰肉堿的代謝輪廓變化有差異，其中發現相對于癌旁組織，中短鏈及長鏈脂酰肉堿在肝癌組織中分別呈現降低及升高的趨勢。而本實驗通過觀察人肝癌肺轉移模型血液的代謝產物的差異，初步揭示了肝癌血行轉移播散的可能生物學物質基礎，提示肝癌的遠處播散轉移可能與血液內氨基酸代謝、脂肪酸代謝、脂質代謝等小分子物質代謝相關。由于非靶向代謝組學的局限性，本次實驗只能初步揭示人肝癌肺轉移模式的血液代謝的輪廓，人肝癌肺轉移模型的肝臟、尿液等組織等其它體液或組織的代謝如何，是否與血液代謝存在差異，可以通過進一步的檢測來逐步揭示。通過對比人肝癌肺轉移裸鼠模型的不同組織不同體液的代謝輪廓和產物我們可以更為精確的得出代謝物質，而后通過靶向代謝組學技術精確定位其中差異明顯的代謝產物，通過相關代謝途徑揭示出肝癌遠處轉移的分子生物學基礎，這有利于闡明肝癌血液轉移的內在途徑和物質基礎。