四逆湯聯合Imatinib抑制乳腺癌耐藥細胞生長的研究

林巾雄 趙華軍 劉倫銘

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，是造成女性死亡的第二大癌癥［1］，目前以手術、化療、放療及內分泌治療為主。氟維司群為乳腺癌內分泌治療的一線用藥，長期用藥通常導致獲得性耐藥問題。因此，耐藥問題已成為治療腫瘤的一大障礙。有研究表明，中西醫結合能顯著提高治療效果，減少化療藥物所帶來的耐藥問題，減少放療、化療的副作用，延長患者生存期［2］。在氟維司群耐藥細胞中，EGFR 異常升高［3］，而同時抑制EGFR 和c-ABL 能有效抑制氟維司群耐藥細胞的生長。研究表明，EGFR 可能是四逆湯一個潛在的作用靶點［4-5］。作為溫陽法的代表方，四逆湯藥理作用廣泛。眾多研究表明［6-7］，四逆湯能夠誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制細胞的增殖。因此，作者旨在探索四逆湯聯合伊馬替尼（c-Abl 抑制劑）能否有效抑制氟維司群耐藥細胞的生長及其誘導凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞株來源 人乳腺癌T47D 細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 藥品與試劑 四逆湯組成藥物制附片、干姜、炙甘草，均購自浙江中醫藥大學杭州濱江中醫門診部。氟維司群（Fulvestrant）、伊馬替尼（Imatinib），美國Sigma-Aldrich 公司；新生牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM/F12 培養基，美國Gibco 公司；青霉素、鏈霉素，生工生物工程有限公司；胰蛋白酶（Trypsin）（1 ∶250），美國Gibco 公司；碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；DMSO，美國Sigma 公司；Annexin Ⅴ/7-AAD 細胞凋亡檢測試劑盒，BD 公司；Bid（#1008-1）、Bcl-xl（#2764）、Bcl-2（#2870）、GAPDH（#5174）、β-tubulin（#2128）、HER2（#4290），美國Cell Signaling Technology 公司；PR（sc-538），美國Santa Cruz 公司；ER（#1115-1），美 國abcam 公 司；Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies（二抗），Cell Signaling Technology公司；ECL 顯影液，BIO-RAD 公司。

1.3 方法 （1）MTT 法檢測細胞生長抑制實驗：取對數期生長的耐藥細胞T47D/Ful，調整細胞濃度，接種至96 孔板，每孔加入100μl 細胞懸液，并控制其細胞濃度為3000 個/孔，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養18h 至貼壁后，每孔加入10μl 藥物，設置系列給藥梯度（四逆湯：10mg、15mg、20mg，生藥25mg/ml，伊馬替尼：15μm、20μm），每個濃度設置4 個副孔，另外設置空白對照組，每孔加入10μl培養基，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養48h 后，每孔加入20μl MTT 溶液，繼續放回培養箱中，4h 后每孔加入200μl 三聯液，將96 孔板放至外用37℃恒溫培養箱中作用18h 后，用Bio-Rad 酶標儀在570nm 時測定吸光度OD 值，最后計算細胞的相對存活率以及相對抑制率。（2）聯合指數及等效線分析法：將MTT 法計算得到的細胞存活率以及對應的藥物濃度用聯合用藥軟件CompuSyn 分析四逆湯與伊馬替尼聯合用藥的聯合指數（Combination Index，CI），并生成等效線圖。CI 指數定義如下：＞1，拮抗作用；=1，疊加作用；＜1，協同作用。（3）流式細胞術檢測細胞凋亡：取對數期生長的氟維司群耐藥乳腺癌細胞T47D/Ful，消化、離心后，調整細胞濃度（8×105個細胞），接種至6cm 皿，18h 后至細胞貼壁，設置對照組、給藥組（伊馬替尼組：20μm，四逆湯組：25mg 生藥/ml，四逆湯、伊馬替尼聯合組），加入藥物作用48h 后，收集細胞，將收集后的細胞用1×Binding Buffer 重懸細胞，分別吸取100μl 細胞懸液至EP 管中，加入FITC-Annexin V 和7-AAD 避光各染10min。最后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。（4）Western Blot 檢測相關蛋白：取對數期生長的氟維司群耐藥乳腺癌細胞T47D/Ful 接種至6cm 皿（8×105個細胞），待細胞貼壁后，隨機分組為對照組、四逆湯組（生藥25mg/ml）、伊馬替尼組（20μM）、四逆湯聯合伊馬替尼組，在培養箱中繼續培養48h，各組加入細胞裂解液，于冰上裂解30min，12000r/min、10min，收集上清液、按照碧云天BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，接下來將處理后的蛋白上樣，用SDS-PAGE 分離目標蛋白，然后用濕轉法轉至PVDF 膜，將封閉后的蛋白條帶用Bid、Bclxl、Bcl-2、GAPDH 等一抗孵育過夜，加入對應的二抗溶液，孵育2h，ECL 顯影液顯影、化學發光儀曝光。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0 統計方法。計量資料以（）表示，各組間數據的比較采用t 檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 T47D/Ful 耐藥細胞敏感性及相關蛋白質表達的鑒定 本實驗中所用的氟維司群耐藥乳腺癌細胞T47D/Ful 由人乳腺癌細胞T47D 經過氟維司群藥物壓力篩選，并采用0.5μm 氟維司群培養約1 年時間得到。作者在實驗展開前對其氟維司群敏感性以及相關蛋白表達進行鑒定。實驗結果顯示（見圖1），耐藥細胞T47D/Ful相較于親代細胞T47D，其對氟維司群的敏感性顯著降低，且耐藥細胞ER、PR 以及HER2 均為陰性表達，表明本研究中所用的T47D/Ful 細胞具有氟維司群耐藥細胞ER、PR 以及HER2 均為陰性的特點，可用于后續的研究。

圖1 T47D/Ful對氟維司群敏感性及ER、PR和HER2蛋白表達鑒定（A：T47D/Ful耐藥細胞相較于親代細胞對氟維司群敏感性顯著下降。B：T47D/Ful耐藥細胞呈現ER、PR及HER2三陰性表達）

2.2 四逆湯與伊馬替尼單獨用藥及聯合用藥對氟維司群耐藥細胞T47D/Ful 增殖的影響 實驗結果顯示（見圖2），四逆湯聯合伊馬替尼能顯著抑制耐藥細胞T47D/Ful 的生長，圖3A 顯示，四逆湯生藥25mg/ml、伊馬替尼20μm 劑量下，具有最佳的聯合效果，且聯合用藥相較于單獨用藥具有顯著性差異；圖3B 顯示，在四逆湯生藥25mg/ml、伊馬替尼20μm 劑量下，具有最小的CI 值，CI＜1，表明此劑量下具有最佳的協同效果。

圖2 四逆湯聯合伊馬替尼對耐藥細胞T47D/Ful的生長抑制作用（A：MTT法測定四逆湯和伊馬替尼對T47D/Ful細胞的生長抑制作用。B：聯合指數及等效線分析法顯示，四逆湯聯合伊馬替尼能協同抑制耐藥細胞T47D/Ful的生長）

2.3 流式細胞術檢測四逆湯與伊馬替尼作用后氟維司群耐藥細胞T47D/Ful 凋亡情況 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，實驗結果顯示（見圖3A、B），四逆湯及伊馬替尼單獨及聯合作用于T47D/Ful 細胞均能有效誘導細胞凋亡，而相較于單獨用藥，聯合用藥能更加顯著地誘導耐藥細胞凋亡。上述結果表明，聯合用藥能有效誘導氟維司群耐藥細胞T47D/Ful 凋亡。

2.4 Western Blot 檢測四逆湯與伊馬替尼作用后T47D/Ful 細胞凋亡相關蛋白 Western Blot 結果顯示（見圖3C），Bid 蛋白表達水平升高，Bcl-2、Bcl-xl 蛋白表達水平下降，表明四逆湯聯合Imatinib 抑制氟維司群耐藥細胞T47D/Ful 生長是通過誘導細胞凋亡實現的。

圖3 四逆湯與伊馬替尼單獨、聯合作用對耐藥細胞T47D/Ful凋亡的影響及凋亡相關蛋白Bid、Bcl-xl、Bcl-2的表達情況（A、B：四逆湯聯合伊馬替尼能顯著上調耐藥細胞T47D/Ful的凋亡比例。C：四逆湯聯合伊馬替尼能顯著上調耐藥細胞Bid的表達、下調Bcl-2、Bcl-xl的表達）

3 討論

近些年來，隨著對中藥研究的深入，中藥在抗腫瘤方面日益展現出其獨特的優勢?，F代研究表明，四逆湯具有提高免疫功能、抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡等作用［7］。作為一個ER 拮抗劑，氟維司群（Fulvestrant）在乳腺癌內分泌治療中起著重要作用［8］，然而在長時間的治療后，目前大部分患者均產生了耐藥性。而研究表明［9-10］，氟維司群內分泌治療失敗后，目前尚無有效方法治療氟維司群耐藥的乳腺癌。因此，尋找新的途徑治療氟維司群耐藥乳腺癌，是目前乳腺癌治療亟待解決的問題。

Liu 等［3］研究表明，用拉帕替尼（Lapatinib，EGFR 抑制劑）和伊馬替尼（Imatinib，c-Abl 抑制劑）能有效抑制氟維司群耐藥細胞FRBC 的生長，且FRBC細胞呈類三陰性性狀，即ER、PR 及HER2 均為陰性表達。因此，為了研究四逆湯聯合伊馬替尼是否也能抑制氟維司群耐藥細胞T47D/Ful 的生長，作者首先通過MTT 實驗、聯合指數及等效線分析法發現四逆湯聯合伊馬替尼能協同抑制氟維司群耐藥細胞T47D/Ful 的生長。

隨后，作者對四逆湯聯合伊馬替尼抑制耐藥細胞T47D/Ful 生長的機制進行研究。發現四逆湯聯合伊馬替尼能顯著誘導T47D/Ful 細胞凋亡比例的升高，且聯合用藥組相較于單獨用藥組具有顯著性差異，表明四逆湯聯合伊馬替尼的效果優于單獨用藥。細胞凋亡是細胞程序性死亡的過程，其中，內質網應激介導凋亡主要是通過調節Bcl-2 家族中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的平衡、調節胞內鈣離子濃度，從而介導細胞凋亡。本實驗結果顯示，四逆湯聯合伊馬替尼能顯著誘導促凋亡蛋白Bid 的表達、抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl 和Bcl-2的表達。

本研究通過系列實驗，初步探究了四逆湯聯合伊馬替尼對氟維司群耐藥乳腺癌細胞T47D/Ful 的作用及機制，闡明了四逆湯聯合伊馬替尼能通過誘導細胞凋亡，從而協同抑制耐藥細胞T47D/Ful 的生長。這為臨床治療氟維司群耐藥乳腺癌提供了一種新的治療策略與思路，對于四逆湯聯合伊馬替尼抑制氟維司群耐藥細胞生長的作用是否存在其它調控機制，有待本課題組進一步研究。