Hcy及其代謝酶基因多態性與急性腔隙性腦梗死的相關性研究

邱玲玲 陳慧 徐小輝 趙江

腔隙性腦梗死（lacunar infarction，LI）是由大腦半球或腦干深部的小的穿通動脈閉塞引起，病灶直徑通常＜1.5cm，是常見的缺血性腦血管疾病，約占腦梗死的20%～30%。目前腔隙性腦梗死的發病機制尚未完全明確，普遍認為該疾病是基因遺傳與環境因素（如高同型半胱氨酸血癥、高血壓等）共同作用的復雜性疾病。高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocystinemia，HHcy）是腦血管疾病的獨立危險因素［1］，血漿同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平受遺傳及環境因素（如低葉酸、低維生素B12）影響，其中基因易感性是影響Hcy 代謝的重要因素，亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR） 是Hcy代謝過程中的關鍵酶，當其677 位點上等位基因C 突變為T 時，使編碼的氨基酸由丙氨酸變成纈氨酸，導致MTHFR 酶活性下降，使Hcy 水平升高［2］。由此可推測MTHFR C677T 基因有可能是腔隙性腦梗死的候選基因。本研究采用病例對照的研究方法，以臺州地區人群為研究對象，運用PCR 及TaqMan 探針技術對MTHFR C677T 進行基因分型檢測，明確該基因位點多態性與急性腔隙性腦梗死的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月至2018 年6 月本院神經內科住院患者及同期體檢中心體檢人員共278 例。急性腔隙性腦梗死146 例（觀察組），其中男87 例，女59 例；平均年齡（63.21±9.97）歲。均符合各類腦血管疾病診斷要點［3］中的腔隙性腦梗死診斷標準，并經頭顱MRI 的DWI 序列證實。排除腦卒中史、側腦室旁多發缺血病灶、腦白質病變、無癥狀性腦梗死、腦出血、顱內占位性病變；排除患有嚴重心功能不全、嚴重肝腎功能障礙、血液病、呼吸衰竭、惡性腫瘤、免疫系統疾病等患者；排除妊娠、心臟瓣膜病、心房顫動等。正常對照組為本院同期體檢中心健康體檢人員共132 例，其中男66 例，女66 例；平均（61.17±9.97）歲。無腦血管意外病史者，經頭顱MRI 檢查證實顯示正常，所有受試者近3 個月均未服用過葉酸、維生素B6、維生素B12，兩組間的年齡、性別差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究經臺州市立醫院倫理委員會批準，研究對象均知情同意。

1.2 研究方法 （1）基本資料收集及相關診斷標準：所有符合對象于入院時記錄年齡、族別、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓病史、糖尿病史、卒中史、冠心病史、家族史及久居地等，測定總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、尿酸（UA）、空腹血糖（FBS）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、Hcy、葉酸等指標。本研究中相關診斷標準如下，飲酒史：≥3 次/周，平均飲白酒≥50ml/次，持續＞1年。吸煙史：幾乎每日吸煙，平均≥1 支/d，持續＞1年。高血壓：收縮壓≥140mmHg（1mmHg=O.133kPa）和（或）舒張壓≥90mmHg 或有高血壓病史并服用降壓藥者［4］。以Hcy 水平＞15μmol/L 定義為HHcy。冠心病包括有客觀證據（如心電圖、動態心電圖或冠狀動脈造影）的心肌缺血、穩定性心絞痛、急性冠脈綜合征、陳舊性心肌梗死、冠狀動脈旁路移植術（CABG）及冠狀動脈介入治療術（PCI）后患者。糖尿?。喊凑?999 年WHO 糖尿病的標準，空腹血糖≥7.0mmol/L、隨機血糖≥11.1mmol/L、糖耐量試驗2h 血糖≥11.1mmol/L 或有糖尿病病史并服用降糖藥者。血脂異常：TC ≥6.2mmol/L，HDL-C＜1.0mmol/L，LDL-C ≥4.1mmol/L，TG ≥2.3mmol/L［5］。（2）標 本采集及DNA 提取：受試者禁食12～14h，采取肘靜脈血送本院實驗室檢測代謝指標。同時早晨靜脈血5ml，加入EDTA 抗凝試管中，嚴格按照MTHFR C677C/T基因檢測試劑盒（深圳奧薩醫藥有限公司）說明書的操作步驟提取基因組DNA，并置于-20℃冰箱保存。（3）引物序列：參照文獻［6］設計引物，上游引物：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’， 下 游 引物：5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’；引物由美國ABI 公司合成。（4）基因多態性檢測：采用PCRTaqMan 探針技術檢測MTHFR C677T 基因（SNP ID：rs1801133）多態性，由浙江友萊醫療器械有限公司完成。具體如下：由美國 ABI 公司設計的兩條MGB 探針，一條以VIC 熒光標記堿基G，對應樣本基因突變位點C；一條以FAM 熒光標記堿基A，對應樣本基因突變位點T。PCR 反應體系：10×PCR buffer 2μl，25mM MgCl21.12L，rTaq 0.8μl，引 物 探 針 0.25μl，DNA 模 板4 μl，100mM dNTP 0.16μl，dd H2O 11.67μl；反應條件：50℃ 2min，95℃預變性2min，95℃ 15s，60℃ 1min，共45 個循環。PCR 擴增在ABI 7500 實時熒光 PCR 儀上進行。產物擴增后使用Genotyping 軟件分析MTHFR C677T 基因分型數據。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0 統計軟件。符合正態分布、方差齊性時計量資料以（）表示；計數資料以n（%）表示；基因型及等位基因頻率分布差異比較采用χ2檢驗；不同基因型間Hcy 水平比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗；數量性狀位點分析采用單因素線性回歸；采用多因素Logistic 回歸分析影響急性腔隙性腦梗死的危險因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般臨床資料 見表1。

2.2 基因型和等位基因頻率分布比較 見表2。

表1 兩組一般臨床資料比較（）

表1 兩組一般臨床資料比較（）

組別 例數 年齡(歲) SBP(mmHg) DBP(mmHg) FBS(mmol/L) UA(μmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L) 葉酸(ng/ml) Hcy(μmol/L)觀察組 146 63.21±9.97 148.09±21.05 83.21±15.45 6.39±2.26 338.75±85.75 2.57±0.79 1.20±0.26 4.44±1.03 1.49±1.37 6.83±3.72 11.15±7.1對照組 132 61.17±9.97 133.58±16.41 79.39±10.57 5.67±1.25 349.33±105.54 2.74±0.88 1.31±0.88 4.76±1.05 1.90±1.37 7.71±3.49 9.96±6.54 t值 1.702 6.003 2.118 3.290 0.892 1.644 1.382 2.541 2.948 1.812 1.319 P值 0.090 ＜0.001 0.035 0.001 0.373 0.101 0.168 0.012 0.004 0.072 0.188

表2 兩組MTHFR C677T基因型和等位基因頻率分布比較［n（%）］

2.3 觀察組和對照組內MTHFR C677T 不同基因型間的Hcy 水平比較 見表3。

表3 兩組MTHFR C677T不同基因型間的Hcy水平比較［μmol/L，（）］

表3 兩組MTHFR C677T不同基因型間的Hcy水平比較［μmol/L，（）］

注：與同組CC型比較，*P＜0.001；與同組CT型比較，#P＜0.001

組別 n CC CT TT F值 P值觀察組 146 9.77±3.56 9.40±3.14 15.77±12.00 *# 11.592 ＜0.001對照組 132 8.65±3.01 9.20±3.51 17.34±15.54*# 11.632 ＜0.001

2.4 MTHFR C677T 基因多態性與代謝指標的數量性狀（QTL）分析 以MTHFR C677T 基因多態性作為自變量，將表1 各代謝指標依次作為因變量，分別分析各代謝指標與該基因多態性是否存在線性回歸。結果發現本實驗位點與葉酸（r=0.293，β=-1.381，t=-4.591，P＜0.001）、Hcy（r=0.332，β=2.966，t=5.481，P＜0.001）存在線性回歸關系，差異有統計學意義，與其它代謝指標差異無統計學意義。

2.5 多因素Logistic 回歸分析 以急性腔隙性腦梗死為因變量，以MTHFR C677T 等位基因T、年齡、性別、高血壓、冠心病、糖尿病、吸煙史、飲酒史、低高密度脂蛋白血癥、高膽固醇血癥、HHcy、頸動脈斑塊作為自變量進行Logistic 回歸分析。結果發現在本實驗中MTHFR C677T 等位基因T、高血壓、冠心病、頸動脈斑塊者對急性腔隙性腦梗死發病有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

本研究發現觀察組及對照組內攜帶TT 型的Hcy水平均高于同組攜帶CC 型及CT 型的Hcy 水平。另外，本研究中MTHFR C677T 基因多態性與代謝指標的數量性狀分析示MTHFR C677T 基因多態性與葉酸（r=0.293，β=-1.381，t=-4.591，P＜0.001）、Hcy（r=0.332，β=2.966，t=5.481，P＜0.001）存在線性回歸關系，提示MTHFR C677T 等位基因T（rs1801133）是與Hcy、葉酸相關的數量性狀位點。

有關HHcy 與心腦血管疾病的相關性一直是國內外研究的熱點，有研究認為HHcy 是腦梗死的獨立危險因素［1］，但HHcy 與腦梗死的各亞型均相關還是與某一種亞型相關，目前尚無定論。Piao X 等［7］通過薈萃分析認為HHcy 與腔隙性腦梗死有關。本研究Logistic 回歸分析提示HHcy 對急性腔隙性腦梗死的發病影響無統計學意義，與Piao X 等的研究結果不一致，但與Zhang 等［8］的實驗結果一致。本研究中HHcy 與急性腔隙性腦梗死的相關性出現陰性結果可能原因如下：（1）腔隙性腦梗死是多基因遺傳與多環境因素共同作用的復雜性疾病，目前認為其基本病因可能是小血管動脈硬化。高血壓病是腔隙性腦梗死的重要危險因素，本文中觀察組與對照組間的基線資料提示兩組間收縮壓與舒張壓差異有統計學意義，且Logistic 回歸分析示高血壓病是急性腔隙性腦梗死的獨立危險因素，這與上述文獻結論一致。HHcy 對急性腔隙性腦梗死的意義有可能被強效危險因素（如高血壓、MTHFR C677T 等位基因T 等）間的交互作用所掩蓋；（2）Hcy的代謝受MHFR C677T 的影響較大，MHFR C677T 突變率（攜帶等位基因T）受種族、地域差異影響較大，在歐美地區突變率呈南高北低的趨勢，而在中國呈南低北高的趨勢［9］，臺州屬于低突變率地區。因此，出現實驗結論不一致且本實驗提示HHcy 與急性腔隙性腦梗死的發病無關有可能與選擇的受試人群有關；（3）HHcy 可能與急性腔隙性腦梗死發病無關；（4）本研究的樣本量偏少。因此未來應擴大樣本量進一步明確HHcy 與急性腔隙性腦梗死的相關性。

MTHFR 基因定位于1 號染色體的1p36.3 上，C677T 是該基因常見的突變位點，其功能是催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸，參與Hcy 的再甲基化過程。本研究發現觀察組和對照組間基因型和等位基因頻率分布差異無統計學意義（P＞0.05），但Logistic 回歸分析示MTHFR C677T 等位基因T 是急性腔隙性腦梗死的獨立危險因素［OR（95%CI）=1.932（1.027，3.632），P=0.041），提示MTHFR C677T 攜帶T 等位基因者患急性腔隙性腦梗死的風險是非T 等位基因攜帶者的1.932 倍。本研究結果認為，MTHFR C677T 是臺州地區急性腔隙性腦梗死的重要遺傳危險因素。但對于該基因與急性腔隙性腦梗死直接相關還是通過與傳統危險因素（如高血壓、糖尿病等）的交互作用再導致急性腔隙性腦梗死的發生目前尚無定論，且相關研究較少。在本研究中觀察組與對照組間的收縮壓與舒張壓差異有統計學意義，Logistic回歸分析示高血壓病是急性腔隙性腦梗死的重要危險因素，提示MTHFR C677T 基因多態性可能通過與高血壓的交互作用影響腔隙性腦梗死的發生。