細胞外基質硬化通過PLCB2促進血管平滑肌細胞遷移

閻巖 史承勇 朱志軍 丁雪燕

血管性疾病作為累及全身重要臟器的系統性病癥，最終可導致急性心肌梗死、腦卒中、晚期腎病等，具有較高的致死率。血管壁的細胞外基質（ECM）主要是由膠原蛋白和彈力纖維蛋白等多種成分構成的復雜動態結構［1］。動脈硬化度取決于血管ECM 中膠原蛋白與彈力纖維蛋白的比例。受年齡增加和高血壓等因素的影響，血管膠原/彈力纖維蛋白比例升高，ECM 硬度增加，血管壁彈力板退化，內中膜增厚，導致動脈壁硬化和管腔狹窄［2］。在此過程中，血管平滑肌細胞（VSMC）感知其周圍ECM 硬度的增加，合成、增殖和遷移能力增強，引起內膜和中膜重塑［3-4］。2018 年1 月至2019 年4 月作者通過實驗研究，探討細胞外基質硬化對VSMC 遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 芯片數據獲取及GSEA 富集分析 自NCBI 中的GEO 數據庫下載GSE100081 表達矩陣數據。其中，樣本GSM2670937～GSM2670940（n=4）和GSM2670941～ GSM2670944（n=4）分別為病理硬度基質和生理硬度基質中培養的人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）的RNA-seq 數據。采用GSEA3.0 版軟件，利用網站MsigDB 數據庫中c2.cp.reactome.v6.2.symbols.gmt 數據集，按照默認加權富集統計方法，設置隨機組合次數為1000 次，進行富集分析。結果中P＜0.01，NES 絕對值＞1.0，且錯誤發現率（FDR）＜20%的基因集判定為顯著富集。

1.2 人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）的培養 HCASMC 及培養基均購自PromoCell 公司。細胞復蘇后，在37℃、5% CO2培養箱中用平滑肌細胞生長培養基（SMCGM2）培養。更換培養液1 次/2d，每3～4 天用0.25%胰酶消化傳代。取5～8 代、經血清饑餓處理24h 的細胞用于實驗。實驗細胞分別接種于彈性指數4KPa（Soft 組）和25KPa（Stiff 組）的6 孔彈性培養板（Softwell，Matrigen 公司），模擬生理和病理性細胞外基質硬度對HCASMC 的影響。

1.3 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR） 采用Trizol 法提取RNA。凝膠電泳檢測RNA 純度后， 按Primescript RT 逆 轉 錄 試 劑 盒（TaKaRa 公司）步驟行逆轉錄合成cDNA。根據SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa 公司）說明書配制20μl反應體系進行qRT-PCR 反應，每個樣本設3 復孔。 實驗所用的引物序列：PLCB2 上游引物：5'-ACCTTCCACAACTTCGTCTCC-3'， 下 游 引 物：5'-GGATGTTTGACTAGGGCCAGT-3'；GAPDH 上游引物：5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'，下游引物：5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'。

1.4 Western blot 檢測蛋白表達 在6 孔板中加入1ml SDS 裂解液，充分裂解細胞，提取總蛋白。采用BCA法測定收集到的上清液濃度，并據此配平各樣品，以保證每孔上樣30μg 蛋白。經8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移至PVDF 膜上。在5%脫脂奶粉中室溫封閉1h 后，4℃下孵育一抗過夜。TBST 緩沖液洗膜3 次后，室溫下孵育二抗1h。采用增強型化學發光試劑（ECL）化學發光法進行檢測。使用Image J 軟件定量蛋白質條帶。

1.5 干擾RNA 的合成和轉染 干擾RNA 的設計，合成及化學改性由吉瑪公司完成。采用lipofectamine 2000 試劑盒，分別將PLCB2 特異性干擾RNA（siPLCB2）和陰性對照干擾RNA（siScramble）轉入病理性外基質硬度培養的HCASMC。轉染12h 后更換培養液，48h后進行實驗。

1.6 平板劃線實驗 取各轉染組細胞，用200μl 移液器槍頭在板底中央做出劃痕，無菌PBS 緩沖液洗板底3 次，去除劃掉的細胞殘渣。分別在劃痕后0h 和24h取樣拍照。以0h 的細胞劃痕寬度為基準畫兩條直線，計數24h 時遷移至2 條直線間的細胞個數，作為遷移能力的定量指標。

1.7 頸動脈內膜損傷模型 選取體重20～25g 的C57BL/6 雄性野生型小鼠，分為頸動脈損傷+siPLCB2轉染組（n=10）和頸動脈損傷+ siScramble 轉染組（n=10），對側血管作為正常對照。小鼠麻醉后，取頸部正中切口，暴露左頸總動脈，用血管夾暫時阻斷血流，再將結扎線置于血管近心端備用。顯微剪剪開頸動脈，插入0.38mm 金屬導絲，旋轉進退摩擦血管壁，造成頸總動脈損傷。退出導絲，結扎近心端。結扎后在損傷段血管周圍局部注射100μl 含有10μg siRNA的Pluronic 凝膠。將對側血管作為假手術組，除不進行導絲損傷外，其余操作相同。術后14d 取出頸總動脈，4%多聚甲醛固定、切片后行HE 染色。利用計算機圖形分析系統檢測血管內膜和中膜面積，計算內膜/中膜（I/M）面積比。

1.8 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以（）表示，兩組間比較采用t 檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GSEA 富集分析 GSEA 富集分析發現，差異表達的基因在Gβγ信號通路（P＜0.001，FDR=0.17）和PLC-β 介 導Gβγ信 號 通 路（P＜0.001，FDR=0.12）兩個基因集中顯著富集（見圖1A），其中PLCB2 的表達在病理硬度基質培養的HCASMC 中顯著上調（logFC=2.78，P＜0.001）（見圖1B）。

圖1 GSEA富集分析

2.2 ECM 硬 化 上 調HCSMC 中PLCB2 表達 為進一步明確ECM硬化對HCASMC 中PLCB2 表達變化的作用，分別在生理性ECM 硬度（Soft）和病理性ECM 硬度（Stiff）中培養HCSMC。qRT-PCR 結果提示Stiff 組中PLCB2 mRNA 的表達量顯著上調（P＜0.001，見圖2A），Western Blot 結 果 也 發 現Stiff 組中PLCB2 蛋白水平顯著高于Soft 組（P＜0.001，見圖2B）。

圖2 兩組HCSMC中PLCB2表達比較

圖3 兩組HCSMC的遷移能力比較

2.3 PLCB2 對硬化基質中HCSMC 遷移的影響 應用干擾RNA 敲低硬化基質培養HCASMC 中PLCB2的表達（siPLCB2），與對照組（siScramble）比較，HCSMC 的遷移能力顯著減弱，差異有統計學意義［（62.33±4.32）VS（49.83±3.4），P=0.046］。見圖3。2.4 PLCB2 對頸動脈內膜損傷后新生內膜的影響 構建小鼠頸動脈內膜損傷模型的同時抑制PLCB2 在損傷動脈段的表達，14d 后觀察實驗組和對照組小鼠頸動脈內膜。siPLCB2 轉染組與同一時間的siScramble 組比較，頸動脈內膜增生受到明顯抑制，新生內膜面積顯著減少［（siPLCB2 組新生內膜面積：（4.43±0.64）×103μm2，I/M：（0.21±0.03）；siScramble 組 新 生 內膜面積：（23.82±1.43）×103μm2，I/M：（1.18±0.06）］。見圖4。

圖4 兩組新生內膜比較

3 討論

各種原因導致的血管阻塞性疾病均伴隨著VSMC遷移、增殖異常活躍和ECM 成分的過度沉積［5］。動脈血管壁內VSMC-ECM 的相互作用在維持血管壁穩態過程中發揮重要作用。研究發現，ECM 硬度能夠影響干細胞的分化方向，不同ECM 硬度條件培養下的間充質干細胞將會向神經源性細胞、肌源性細胞和成骨細胞等不同的方向分化［6］。近年來研究發現，VSMC可感知動脈硬化病程中ECM 硬度的增加并響應性出現表型轉化，表現為增殖、遷移能力增強，同時合成分泌功能活躍，進一步促進血管ECM 重塑［7］。

本研究通過分析病理和生理性ECM 硬度條件下培養的HCASMC 表達譜芯片數據，發現差異表達的基因在Gβγ信號通路和PLC-β 介導的Gβγ信號通路兩個基因集中顯著富集，且兩個信號通路中的關鍵分子PLCB2 表達顯著上調。進一步細胞學實驗也證實，病理性ECM 硬度能夠明顯上調HCASMC 中PLCB2 的蛋白水平。PLC-β 是磷脂酶C 的β 型同工酶，存在PLCB1～4 共4 種分子亞型。有研究報道PLCB1 和PLCB3 亞型廣泛存在于多種細胞類型中，而PLCB2 僅在機械力敏感的細胞內表達［8］，提示其在細胞響應周圍環境機械力學信號方面發揮重要作用。作者采用彈性指數25Kpa 的特制培養板刺激HCASMC，模擬血管硬化狀態下病理性ECM 硬度，結果發現PLCB2 mRNA和蛋白水平均顯著上調，表明HCASMC 在感知周圍異常增高的ECM 硬度后反應性的上調PLCB2 表達，提示其在VSMC 響應ECM 硬化過程中起關鍵作用。

本研究通過細胞劃痕實驗發現敲低PLCB2 表達能夠明顯抑制病理性ECM 硬度對HCASMC 的促遷移作用。既往研究顯示，頸動脈內膜損傷能夠引起血管ECM 硬化、新生內膜形成和管腔狹窄［9］。因此，為進一步明確PLCB2 對VSMC 遷移的影響，構建小鼠頸動脈內膜損傷模型并通過外膜轉染PLCB2 特異性干擾RNA，結果發現siPLCB2 可明顯抑制損傷后新生內膜的形成。作為PLC-β 的重要亞型，PLCB2 通過水解磷脂酰肌醇4，5 二磷酸（PIP2），產生第二信使分子二乙酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3）。IP3 可進一步作用于胞內敏感的Ca2+儲存庫，使胞內Ca2+濃度增加，而DAG 又可激活蛋白激酶C。因此，PLCB2 的表達上調可通過多種途徑發揮生理效應，而其參與ECM硬化條件下VSMC 過度遷移的具體機制有待今后深入研究。

綜上所述，病理性ECM 硬度可上調VSMC 中PLCB2 的表達，干擾抑制PLCB2 能夠有效抑制VSMC的過度遷移，減輕新生內膜的形成。該研究結果加深了對血管基質硬化調控VSMC 功能的了解，為動脈硬化的診斷和治療提供新的潛在靶點。