長鏈非編碼RNA OR3A4在非小細胞肺癌中的作用及其機制探討

李珊珊 顧文超

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，也是導致癌癥死亡的主要原因。據估計，2018 年全球新增病例為2093876 例，死亡人數為1761007 人［1］。肺癌的主要組織學亞型是非小細胞肺癌（NSCLC），主要包括腺癌和鱗狀細胞癌，約占肺癌的80%［2］。雖然近年來NSCLC 的臨床治療取得了越來越多的進展，但NSCLC患者的總體生存時間并未顯著提高。因此，揭示非小細胞肺癌發生、發展的潛在分子機制，以開發新的非小細胞肺癌治療策略具有重要意義。近年來，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）因其豐富的調控手段在基因轉錄后調節中的作用越來越受到重視，其中長鏈非編碼RNA（lncRNA），一類長度＞200 個核苷酸、編碼能力有限的非編碼轉錄產物，逐漸引起了人們的關注。研究發現lncRNA 在多種人類腫瘤中異常表達，在生物過程發揮重要作用，包括生長、細胞分化、增殖、凋亡和侵襲，發揮促癌或者抑癌基因的重要作用［3］。一些lncRNA 被報道在NSCLC 中具有致癌或抑制腫瘤的作用［4-5］。lncRNA OR3A4 是新近發現的一種lncRNA，在乳腺癌和胃癌中表達上調，促進癌癥的發生發展［6］。然而，lncRNA OR3A4 在NSCLC 中的表達、作用及作用機制尚不清楚。本研究旨在探討RNA OR3A4 在NSCLC 中的作用和機制，報道如下。

1 材料和方法

1.1 臨床標本和倫理聲明 在患者知情同意的情況下，經浦東新區人民醫院倫理委員會按照國際標準批準，從浦東新區人民醫院獲得30 對NSCLC 組織及相鄰非癌性肺組織樣本。另外，10 例NSCLC 骨轉移組織也取自浦東新區人民醫院手術的NSCLC 患者。所有患者術前均未接受放療或化療。組織標本冷凍保存于- 80℃冷凍箱。

1.2 細胞培養和轉染 人NSCLC 細胞株（A549、SPC-A1、H1299 和SK-MES-1）和HEK293T 細 胞 購自中國科學院細胞庫（上海），PC-9 細胞和人支氣管上皮（HBE）細胞購自ATCC（馬納薩斯，弗吉尼亞州，美國）。用DMEM 或RPMI1640 培養基培養NSCLC 細胞株。使用Lipofectamine 2000 按照制造商的協議進行細胞轉染。

1.3 qRT-PCR 分析 使用TRIzol?試劑從組織或細胞中提取總RNA。采用PrimeScript?RT 試劑試劑盒（TaKaRa，大連，中國）合成互補DNA，采用SYBR預混料Ex Taq II（TaKaRa）進行qRT-PCR 分析。β-actin作為標準化的對照。采用2-ΔΔCT方法計算相對基因表達水平。

1.4 Western blot 實驗 用RIPA 緩沖液制備細胞裂解液。在10%凝膠上用SDS-PAGE 分離等量的蛋白質，并轉移至聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉1h。在4℃下用一級抗體將細胞膜培養過夜。使用的主要抗體如下：KLF6（Proteintech，武漢，中國）和β-actin（Proteintech）。將二抗37℃孵育1h 后，用增強的化學發光系統檢測觀察條帶。

1.5 質粒構建和細胞轉染 針對（shOR3A4）和陰性對照（shCtrl）的特異性shRNA 寡核苷酸購自上海吉瑪制藥技術有限公司。將編碼OR3A4 的互補DNA 經PCR 擴增后插入pcDNA3.1（Invitrogen）中。細胞轉染采用Lipofectamine 2000 進行。

1.6 細胞增殖檢測 使用CCK-8 試劑盒評估細胞增殖能力。在96 孔板中每孔接種2000 個轉染細胞，在不同時間點（接種后1d、2d、3d 和4d）檢測細胞活力。在490nm 處用分光光度微平板閱讀器測定吸光度。平板克隆形成實驗：將轉染后的細胞接種于6 孔板（1×103/孔）中，連續培養10d。更換培養基1 次/3d。實驗結束時，用4%多聚甲醛固定細胞，結晶紫染色。在顯微鏡下計算細胞克隆數量。

1.7 細胞凋亡測定 采用Annexin V-Alexa Fluor 647/ PI 凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。轉染細胞用膠原酶消化，收集細胞，用annexin V-Alexa Fluor 647 和PI在室溫下染色15min。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 細胞遷移實驗 收集轉染細胞，以每孔1×105個細胞的密度接種至上腔室。下室加入含有10% FBS 的500μl 細胞培養基。12h 后，用棉簽取出細胞膜上表面的細胞。然后用甲醛固定下層細胞，用結晶紫染色30min。遷移細胞的數量在顯微鏡下計數。

1.9 細胞侵襲實驗 將各室加入稀釋后的基底基質凝膠37℃下聚合30min。轉染細胞以2×105個細胞/孔的密度接種于上腔室。下室加入含有10% FBS 的500μl 細胞培養基。這些細胞被允許進入下膜24h。隨后，用棉簽取出細胞膜上表面的細胞。然后用甲醛固定下層細胞，用結晶紫染色30min。在顯微鏡下計數細胞遷移數。

1.10 體內實驗 動物實驗是在動物研究機構委員會的批準下進行的，嚴格按照美國國立衛生研究院實驗室動物護理和使用指南中的建議。雌性athymic BALB/c 小鼠（5 周齡）購自河南實驗動物中心（鄭州，中國），在特定的無致病性條件下培養。將穩定表達shCtrl 或shOR3A4 的A549 細胞（1×106）或穩定表達Ctrl 或OR3A4 的H1299 細胞（1×106）皮下注射于裸鼠側翼兩側（n=6 只/組）。測量腫瘤體積1 次/5d，計算公式為體積=（長×寬×0.5）。25d 后小鼠被處死，并對腫瘤進行稱重。

1.11 統計學分析 采用GraphPad Prism（Version 5.0，GraphPad Software，Inc）軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用t 檢驗或方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OR3A4 在NSCLC 細胞系和組織中表達上調 為了探討OR3A4 在NSCLC 中的作用，采用qRT-PCR檢測了30 對NSCLC 組織樣本及相鄰非癌性肺組織中OR3A4 的表達情況。OR3A4 在NSCLC 組織標本中的表達明顯高于鄰近非癌性肺組織標本（P＜0.05）（見圖1A）。此外，作者收集了10 例NSCLC 骨轉移組織，并測定了OR3A4 的表達。結果顯示OR3A4 在骨轉移組織中的表達高于原發性NSCLC 組織（P＜0.05）（見圖1B）。此外，與HBE 細胞比較，OR3A4 在NSCLC 細胞 株（A549、SPC-A1、PC-9、SK-MES-1 和H1299）中的表達較高（P＜0.05）（見圖1C）。

圖1 OR3A4在NSCLC組織樣本和細胞系中上調。A：OR3A4在30對NSCLC和非癌性肺組織樣本中的表達的定量分析，與正常相比較，＊P＜0.05。B：OR3A4在30個原發性NSCLC組織和10個骨轉移組織樣本中的表達的定量分析，與原發性NSCLC比較，＊P＜0.05。C：定量OR3A4在NSCLC細胞系和正常HBE細胞中的表達，與HBE組比較，＊P＜0.05。

2.2 下調OR3A4 表達抑制NSCLC 細胞增殖、侵襲和遷移 為了研究OR3A4 在NSCLC 中的作用，使用shRNA 下調了OR3A4 在NSCLC 細胞中的表達。qRTPCR 驗證了基因沉默的有效性（見圖2A）。用CKK-8法和平板克隆形成實驗測定了A549 細胞的增殖能力。結果表明，下調OR3A4 表達可顯著抑制A549 細胞的增殖速率（見圖2B）。菌落形成實驗結果表明，與對照組比較，下調OR3A4 的A549 細胞形成的菌落明顯減少（見圖2C）。作者用流式細胞術測定了OR3A4的下調對A549 細胞凋亡的影響。如圖2D 所示，在A549 細胞中，OR3A4 敲低顯著增加了凋亡細胞的百分比。然后在體外評估了OR3A4 敲低對NSCLC 細胞轉移潛能的影響。Transwell 遷移實驗結果顯示，與對照組比較，OR3A4 敲低組的細胞遷移更少（見圖2E）。此外，基質凝膠侵入的結果實驗表明，OR3A4 敲低也抑制了A549 細胞的侵襲能力（見圖2F）。

圖2 OR3A4敲低抑制NSCLC細胞的增殖、侵襲和遷移。A：qRT-PCR分析轉染shCtrl 和shOR3A4的A549細胞中OR3A4的表達。B：采用CCK-8法測定shCtrl 和shOR3A4兩組的細胞增殖能力。C：檢測shCtrl 和shOR3A4兩組的細胞克隆形成能力。D：流式細胞術分析shCtrl和shOR3A4轉染的A549細胞的凋亡情況。E：采用Transwell遷移實驗檢測下調OR3A4表達后A549細胞的遷移能力。F：采用基質凝膠侵襲法對轉染shOR3A4的 A549細胞進行侵襲性檢測。與ShCtrl組比較，＊P＜0.05。

2.3 上調OR3A4 表達促進NSCLC 細胞增殖、侵襲和遷移 使用pcDNA3.0 上調了OR3A4 在NSCLC 細胞中的表達。qRT-PCR 驗證了基因沉默的有效性（見圖3A）。用CKK-8 法和平板克隆形成實驗測定了H1299細胞的增殖能力。結果表明，上調OR3A4 表達可明顯促進H1299 細胞的增殖速率（圖3B）。菌落形成實驗結果表明，與對照組比較，上調OR3A4 的H1299 細胞形成的菌落明顯增加（見圖3C）。作者用流式細胞術測定了OR3A4 的上調對H1299 細胞凋亡的影響。（如圖3D）所示，在H1299 細胞中，OR3A4 過表達顯著降低了凋亡細胞的百分比。然后在體外評估了OR3A4過表達對NSCLC 細胞轉移潛能的影響。Transwell 遷移實驗結果顯示，與對照組比較，OR3A4 過表達組的細胞遷移增加（見圖3E）。此外，基質凝膠侵入的結果實驗表明，OR3A4 過表達也促進了H1299 細胞的侵襲能力（見圖3F）。

2.4 下調OR3A4 表達抑制NSCLC 腫瘤生長，但上調其表達促進NSCLC 腫瘤生長 為進一步證實OR3A4在NSCLC 中的生物學作用，將穩定轉染shCtrl 或shOR3A4 的A549 細胞，或穩定轉染Ctrl 或OR3A4的H1299 細胞皮下注射到裸鼠體內。測量腫瘤體積1次/5d，并進行腫瘤注射25d 后稱重。結果表明，與shCtrl 組比較，OR3A4 的下調顯著抑制了體內腫瘤的生長，包括平均腫瘤體積（見圖4A）和體重（見圖4B）；OR3A4 的上調明顯促進了體內腫瘤的生長，包括平均腫瘤體積（見圖4C）和體重（見圖4D）。

圖3 OR3A4過表達促進NSCLC細胞的增殖、侵襲和遷移。A：qRT-PCR分析轉染OR3A4過表達質粒以及空白質粒的H1299細胞中OR3A4的表達。B：采用CCK-8法測定Ctrl和OR3A4轉染的H1299細胞的細胞增殖能力。C：檢測Ctrl 和OR3A4兩組的細胞克隆形成能力。D：流式細胞術分析Ctrl和OR3A4轉染的H1299細胞的凋亡情況。E：采用Transwell遷移實驗檢測過表達OR3A4表達后H1299細胞的遷移能力。F：采用基質凝膠侵襲法對轉染OR3A4過表達質粒的 H1299細胞進行侵襲性檢測。與Ctrl組比較，＊P＜0.05。

圖4 下調OR3A4抑制NSCLC腫瘤生長，上調OR3A4則促進NSCLC腫瘤生長。A：將穩定表達shCtrl或shOR3A4的A549細胞皮下注射于裸鼠，測量腫瘤體積1次/5d。B：腫瘤重量。C：將穩定表達Ctrl或OR3A4的H1299細胞皮下注射于裸鼠，測量腫瘤體積1次/5d。D：腫瘤重量。與Ctrl組比較，＊P＜0.05。

2.5 OR3A4 通過抑制KLF6 表達影響NSCLC 細胞生物學功能 已有報道OR3A4 通過抑制KLF6 促進卵巢癌的轉移［7］。KLF6 在NSCLC 中具有抑癌作用［8］。因此，作者首次研究OR3A4 是否也調控NSCLC 中KLF6的表達，以及OR3A4 在NSCLC 中的致癌作用是否依賴于KLF6 的調控。采用qRT-PCR 和western blot 檢測KLF6 在OR3A4 穩定過表達的H1299 細胞和OR3A4敲低的A549 細胞中的表達。結果顯示KLF6 過表達下調了PXN mRNA 和蛋白水平，而敲低OR3A4 表達后上調PXN mRNA 和蛋白水平。另外，在OR3A4 過表達的H1299 細胞中轉染KLF6 過表達載體明顯抑制了OR3A4 對細胞增殖、侵襲和遷移的促進作用，而在shOR3A4 敲低的H1299 細胞中轉染KLF6 敲低載體顯著抑制了OR3A4 對細胞增殖的抑制作用。提示OR3A4 在NSCLC 中的促癌作用至少部分依賴于KLF6的負向調控。

3 討論

在過去的十年中，各種lncRNA 被發現在癌癥的發病機制中發揮著重要的作用［9-10］。在本研究中，作者發現OR3A4 在NSCLC 組織和細胞株中表達上調。OR3A4 過表達促進NSCLC 細胞增殖、遷移和侵襲，而下調OR3A4 表達則抑制NSCLC 細胞增殖、遷移侵襲和腫瘤生長。另外，進一步證明了OR3A4 在NSCLC 中的作用可能通過抑制KLF6 表達。結果表明OR3A4 在NSCLC 中發揮致癌作用。

本資料數據表明，OR3A4 的表達上調可能有助于NSCLC 的進展，這在其他癌癥中也有類似的發現。Li等［11］證明OR3A4 通過調控AGGF1/akt/mTOR 通路參與肝細胞癌血管生成，證實OR3A4 是肝癌進展和血管生成的促進劑。在胃癌中，過表達OR3A4 促進胃癌細胞生長，血管生成和轉移，并且證明了OR3A4 通過調節PDLIM2、MACC1、NTN4、GNB2L1 的活化，影響胃癌細胞的生物學功能［6］。OR3A4 在卵巢癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織。此外，OR3A4 基因在體外敲除后，細胞遷移和侵襲受到明顯抑制［7］。此外，在乳腺癌中，OR3A4 在乳腺癌組織和細胞中表達上調，并與臨床病理特征相關。下調OR3A4 表達通過影響細胞周期和凋亡抑制乳腺癌細胞的增殖，并通過EMT 抑制細胞轉移，過表達OR3A4 取得相反實驗結果。結果表明，OR3A4 是一種潛在的診斷生物標志物和治療目標的各種癌癥。

大量研究表明，KLF6 可以作為腫瘤抑制因子，調控增殖、遷移、分化、凋亡、細胞周期和血管生成等多種基本細胞功能，從而抑制腫瘤的發生［12］。KLF6通過下調間質標志物和抑制MMP-9 活性，抑制口腔癌的遷移和侵襲。KLF6 通過轉錄抑制E2F1 抑制透明細胞腎細胞癌的轉移。Guo 等［7］指出OR3A4 通過抑制KLF6 促進卵巢癌的轉移。另外有研究表明，KLF6在NSCLC 中表達下調，并通過誘導NSCLC 細胞凋亡抑制腫瘤生長，這可能提示KLF6 是NSCLC 的抑癌因子［8］。本研究中，在NSCLC 細胞中過表達OR3A4 顯著降低KLF6 表達，而降低OR3A4 表達則明顯促進KLF6 表達。另外結果證明NSCLC 細胞中轉染KLF6可以顯著減輕OR3A4 對NSCLC 細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響。說明OR3A4 可能通過抑制KLF6 表達促進NSCLC 細胞增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，OR3A4 至少部分地通過KLF6 沉默促進NSCLC 細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究為OR3A4 在NSCLC 進展中的作用提供了新的證據，并為NSCLC 的診斷和治療提供了一個潛在的標志物。