慢性應(yīng)激狀態(tài)下糖尿病大鼠海馬代謝改變的1H NMR研究

徐雯 沈起鈞 單嫣娜 賴旭峰 陳文輝

抑郁是糖尿病的常見并發(fā)癥之一。糖尿病患者的抑郁與亞臨床抑郁癥狀發(fā)生率顯著高于普通人群，且其藥物依從性及血糖控制較差，導(dǎo)致并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高［1］。慢性應(yīng)激是抑郁及其它應(yīng)激相關(guān)情緒障礙的重要發(fā)病因素，其所導(dǎo)致的腦內(nèi)解剖結(jié)構(gòu)、電生理及神經(jīng)化學(xué)等多個(gè)方面的變化，已被研究證實(shí)與糖尿病并發(fā)認(rèn)知功能障礙模型中觀察到的相關(guān)變化類似［2］，提示慢性應(yīng)激可能與糖尿病相關(guān)認(rèn)知障礙及其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有大量研究證明海馬與認(rèn)知功能密切相關(guān)，且糖尿病及慢性應(yīng)激刺激均可導(dǎo)致海馬解剖結(jié)構(gòu)、神經(jīng)元可塑性以及代謝調(diào)控等一系列病理生理變化［3-4］。然而，目前關(guān)于慢性應(yīng)激刺激背景下糖尿病大腦中海馬的代謝變化情況的相關(guān)報(bào)道相對較少。本研究旨在應(yīng)用核磁共振氫譜（1H NMR）檢測慢性不可預(yù)測輕度應(yīng)激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）對糖尿病大鼠海馬代謝的影響，為糖尿病并發(fā)抑郁的發(fā)病機(jī)制研究提供基礎(chǔ)，并為相關(guān)臨床治療提供理論依據(jù)及新思路。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：20 只普通級雄性Wistar 大鼠（6 周），許可證編號(hào)：SYXK（浙）2010-0150，體重155.2～168.7g，平均（163.4±3.89）g，每籠4 只。置于安靜舒適實(shí)驗(yàn)環(huán)境，普通飼料飼養(yǎng)，自然晝夜節(jié)律光照，平均室溫22℃～25℃，空氣濕度50%～60%，并可自由進(jìn)食進(jìn)水。（2）主要藥品、試劑及儀器：Bruker AVANCE III 600 核磁共振譜儀（Bruker BioSpin International AG）；血糖儀（德國貝朗醫(yī)療國際貿(mào)易有限公司）；冷凍干燥機(jī)（FD-1，北京德天佑科技發(fā)展有限公司）；勻漿機(jī)（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）；鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）。

1.2 研究方法 （1）動(dòng)物分組及模型建立：所有大鼠禁食16h 后一次性腹腔注射STZ（溶于新鮮配制的0.1mol/L，pH=4.5 枸櫞酸緩沖液中，4℃保存）64mg/kg。注射后72h 尾靜脈采血測血糖，隨機(jī)血糖＞16.7mmol/L 并保持＞3d 即成功建立糖尿病大鼠模型。隨后按隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行分組：糖尿病組（即DM 組，n=6 只）、糖尿病慢性應(yīng)激組（即DC 組，n=14 只）。將所有DC 組大鼠每日暴露于一種CUMS 方法［5］并持續(xù)4 周，應(yīng)激包括群居飼養(yǎng)（7 只/籠）、潮濕墊料（500ml/籠）、鼠籠傾斜40°、夾尾1min、頻閃光照（300 flashes/min）6h、白噪音［（80±5）db］6h、4℃冰水游泳5min。DM 組不做處理，每日自由進(jìn)食進(jìn)水。CUMS 處理完成后，兩組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評估［6］。（2）行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：包括Open-field 實(shí)驗(yàn)及Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)。Open-field 實(shí)驗(yàn)：將大鼠放入底面劃分成25 個(gè)面積相等方格的敞箱正中格，使其自由活動(dòng)5min 并同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)。Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)：直徑1.5m 的圓形水池，平臺(tái)直徑0.13m，水深0.3m，水面高出平臺(tái)2cm。連續(xù)訓(xùn)練4d，每次將大鼠貼壁放入水中，觀察并計(jì)時(shí)60s，若60s 內(nèi)未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其至平臺(tái)，停留15s。第5 天撤除平臺(tái)，將大鼠從距原平臺(tái)最遠(yuǎn)的象限面壁放入水中，攝像系統(tǒng)記錄大鼠在60s 內(nèi)活動(dòng)數(shù)據(jù)。（3）海馬組織的制備及1H NMR 檢測：所有大鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后斷頭處死，并將收集的海馬組織樣本浸入液氮中急凍，置于-80℃保存。冰凍的海馬組織樣本在提取水溶性的小分子代謝物后，在液氮中冷凍，并放入真空凍干機(jī)中凍干24h。將得到的代謝物粉末重新溶解，低溫離心后取上清液，轉(zhuǎn)入NMR 樣品管中進(jìn)行測試。使用Bruker AVANCE III 600MHz NMR 譜儀采集組織樣本的1H NMR 譜。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠一般情況及體重變化 兩組大鼠進(jìn)食及飲水量增加，體質(zhì)量逐漸下降，明顯消瘦，毛色晦暗，二便增多，DC 組大鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍。兩組大鼠于應(yīng)激前后均始終保持高水平隨機(jī)血糖（＞33.3mol/L）。以應(yīng)激前后大鼠體質(zhì)量作為監(jiān)測指標(biāo)，兩組大鼠體質(zhì)量均呈下降趨勢，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見圖1）。

2.2 兩組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)比較 （1）Open-field 實(shí)驗(yàn)：DC 組大鼠的總路程、活動(dòng)時(shí)間及活動(dòng)次數(shù)均較DM 組減少（P＜0.05，見圖1）。（2）Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)：在空間探索實(shí)驗(yàn)中，DC 組大鼠的站臺(tái)穿越次數(shù)較DM 組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 慢性應(yīng)激刺激后兩組大鼠體質(zhì)量變化［g，（）］及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（注：與DM組比較，DC組在Open-field實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)次數(shù)（a）、活動(dòng)時(shí)間（b）及總路程（c）明顯減少；在Morris水迷宮探索實(shí)驗(yàn)中，DC組的站臺(tái)穿越次數(shù)較DM組明顯減少（d）。CUMS處理第0、14、28天，DC組與DM組大鼠體質(zhì)量均無顯著差異。＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

2.3 兩組NMR 波譜和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 兩組大鼠海馬的典型1H NMR 波譜圖見圖2。兩組大鼠海馬提取物1H NMR 譜中譜峰的歸屬參照文獻(xiàn)［7］。與DM 組相比，DC 組大鼠海馬中的谷氨酸及谷氨酰胺含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1），其余所測得代謝物于兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

圖2 兩組大鼠海馬的典型1H NMR波譜圖

表1 1H NMR方法分析兩組大鼠海馬中各代謝物含量［mmol/kg，（）］

表1 1H NMR方法分析兩組大鼠海馬中各代謝物含量［mmol/kg，（）］

代謝物 譜峰（ppm） 海馬DM組 DC組 P值Lac δ1.31-1.34 103.49±4.94 101.92±6.34 0.66 Ala δ1.46-1.49 5.52±0.81 6.01±0.41 0.05 NAA δ2.01-2.02 33.60±1.81 34.00±2.13 0.74 GABA δ2.27-2.31 9.39±0.69 9.64±0.35 0.32 Glu δ2.33-2.38 41.61±1.83 44.33±1.41 0.01 Suc δ2.39-2.41 2.90±0.56 3.41±0.60 0.15 Gln δ2.45-2.50 18.66±0.72 19.55±0.66 0.03 Asp δ2.80-2.82 4.07±0.18 4.50±0.54 0.15 Cre δ3.03-3.05 48.57±2.23 48.75±2.01 0.88 Cho δ3.19-3.20 2.22±0.50 2.00±0.35 0.32 Tau δ3.40-3.44 27.35±1.39 27.03±1.73 0.73 Gly δ3.54-3.56 3.31±0.18 3.27±0.24 0.75 m-Ins δ3.60-3.64 32.84±1.53 33.23±1.17 0.59

3 討論

本研究采用一次性腹腔注射STZ 建立糖尿病模型，之后利用CUMS 方法模擬慢性應(yīng)激環(huán)境，實(shí)驗(yàn)中觀察到兩組大鼠均出現(xiàn)進(jìn)食及飲水量增加，體重下降，毛色晦暗，二便增多等典型糖尿病癥狀，而DC 組又表現(xiàn)出精神萎靡、反應(yīng)遲鈍等抑郁樣癥狀。CUMS 方法模擬了日常生活中的慢性應(yīng)激事件，其已被大量研究證實(shí)可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生類抑郁狀態(tài)［5］。Open-field 實(shí)驗(yàn)是基于嚙齒類動(dòng)物同時(shí)有畏懼空曠場地和探究新事物、新環(huán)境的天性，用于評價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。本研究中，DC 組大鼠在實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)總路程、活動(dòng)次數(shù)及活動(dòng)時(shí)間均較DM 組大鼠明顯減少，反映其對未知環(huán)境的好奇程度及探索能力明顯下降。Morris 水迷宮廣泛用于評價(jià)嚙齒類動(dòng)物空間位置感及方向感的學(xué)習(xí)及記憶能力。本研究中，DC 組大鼠在第5 天的空間探索實(shí)驗(yàn)中穿越平臺(tái)位置的次數(shù)較DM 組明顯減少，表明其對平臺(tái)位置及方向的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。上述DC 組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)與臨床上慢性應(yīng)激引起的抑郁狀態(tài)患者出現(xiàn)情緒低落、興趣缺失、學(xué)習(xí)記憶力減退的癥狀相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

質(zhì)子核磁共振是一種強(qiáng)大的用于研究腦能量代謝、神經(jīng)傳遞和神經(jīng)膠質(zhì)-神經(jīng)元相互作用的方法。離體1H NMR 技術(shù)在檢測靈敏度、區(qū)域特異性和代謝物譜峰的分散方面較在體NMR 技術(shù)有明顯優(yōu)勢。與核磁共振波譜相比，由于離體1H NMR 技術(shù)在超高場強(qiáng)下運(yùn)行，因此除了可以提供更全面、更準(zhǔn)確和更多樣的代謝信息外，亦能對目標(biāo)代謝物進(jìn)行絕對定量分析，這有助于更精確的判斷代謝物的變化趨勢。1H NMR 避免了對生物樣品的損傷，減少了分離純化等操作，在不影響其代謝變化的條件下，給出了組織內(nèi)Glu、Gln、GABA、Cre、NAA、Cho、Gly、Asp、Ala、Lac、Tau 等神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的信號(hào)［7］。

海馬是參與認(rèn)知能力、近期記憶、學(xué)習(xí)和注意力的重要腦區(qū)，神經(jīng)影像學(xué)研究表明糖尿病及慢性應(yīng)激均可影響海馬的結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)、突觸可塑性及神經(jīng)電生理等，與認(rèn)知功能障礙的發(fā)生關(guān)系密切［8-9］。在代謝層面上，以往關(guān)于糖尿病或慢性應(yīng)激相關(guān)的抑郁所導(dǎo)致的多個(gè)腦區(qū)的代謝物變化已有大量報(bào)道，但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于慢性應(yīng)激背景下糖尿病大鼠海馬代謝改變的相關(guān)報(bào)道。本研究利用1H NMR 方法進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激刺激后的糖尿病大鼠海馬中谷氨酸及谷氨酰胺水平較無慢性應(yīng)激刺激的糖尿病大鼠明顯增高。這一結(jié)果可能與海馬神經(jīng)元谷氨酸釋放量增加及突觸間隙谷氨酸清除障礙有關(guān)［10-12］。作者認(rèn)為慢性應(yīng)激是引起糖尿病大鼠海馬谷氨酸水平升高的重要因素，其可能在糖尿病合并抑郁的發(fā)病過程中起到重要作用。

本研究的不足之處在于缺乏對該過程中海馬神經(jīng)元EAAT 表達(dá)情況變化的探究，這也是本課題組下一步的研究方向，即采用RT-PCR 技術(shù)對糖尿病慢性應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)元谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT 的核酸表達(dá)進(jìn)行檢測，進(jìn)一步闡明慢性應(yīng)激對糖尿病大鼠海馬谷氨酸代謝產(chǎn)生的影響。

綜上所述，本研究運(yùn)用1H NMR 技術(shù)檢測了慢性應(yīng)激狀態(tài)下的糖尿病大鼠模型的海馬代謝變化情況，為糖尿病合并抑郁的發(fā)病機(jī)制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)及潛在的治療靶點(diǎn)。