25-羥基膽固醇對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的影響及其機(jī)制

羅瀚文，何航元，袁明武，張 明,樂(lè)國(guó)平

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是指各種因素所導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生原發(fā)性或繼發(fā)性退行性改變以及骨質(zhì)增生，并伴有不同程度滑膜炎癥。隨著我國(guó)人口老齡化的加快，OA的發(fā)病率也出現(xiàn)逐年增加的勢(shì)頭，并且已成為危害中老年人健康及生活的主要原因之一。大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，OA發(fā)病率在65歲以上老年人中高達(dá)33.6%[1]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為OA屬于老年退行性關(guān)節(jié)病變，其致病因素主要與年齡、性別、創(chuàng)傷等因素有關(guān)[2]。近年越來(lái)越多的學(xué)者提出，OA與全身代謝紊亂有關(guān)，甚至提出OA可能屬于代謝綜合征的范疇[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，OA與心腦血管疾病存在十分緊密的聯(lián)系，其發(fā)生與血膽固醇水平存在顯著的相關(guān)性[4-6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，OA患者的軟骨細(xì)胞內(nèi)存在膽固醇蓄積，從而抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，降低關(guān)節(jié)軟骨的質(zhì)量[7-8]。雖然已知膽固醇在OA的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用，但目前關(guān)于膽固醇對(duì)OA的作用機(jī)制仍不明了。因此，本研究擬通過(guò)OA大鼠軟骨細(xì)胞模型，檢測(cè)不同濃度25-羥基膽固醇對(duì)軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成及降解、膽固醇流出通路相關(guān)基因的mRNA表達(dá)的影響，探討膽固醇在OA發(fā)生過(guò)程中對(duì)軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制，為闡明OA的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；青霉素、鏈霉素粉末(美國(guó)Sigma公司)；鼠白介素-1β(IL-1β，美國(guó)PEPRO TECH公司)；Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)；RT-PCR試劑盒(日本 Takara 公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州主諾生物技術(shù)有限公司)；乙醇、異丙醇、三氯甲烷(上海浩然生物科技有限公司)；組織總膽固醇(total cholesterol， TCH)測(cè)定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；引物合成(上海生工公司)；其余試劑為分析純。

1.2大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)和分組 健康SPF級(jí)Wistar大鼠(180～220 g)購(gòu)于湖北省疾病預(yù)防控制中心。在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌操作獲得大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，在37℃水浴中用0.2% Ⅱ型膠原酶消化關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本至絮狀。加入全培養(yǎng)液并重新懸浮以得到軟骨細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿后傳代培養(yǎng)。調(diào)整P3代細(xì)胞濃度為1×105/ml，接種于六孔板內(nèi)用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。接種24 h后撤掉血清，將培養(yǎng)孔分為對(duì)照組(正常軟骨細(xì)胞不予任何處理)，模型組(用20 ng/ml IL-1β處理48 h制備OA模型)，5、25、125 μmol/L 25-羥基膽固醇處理組(先用各劑量25-羥基膽固醇處理24 h后，加入20 ng/ml IL-1β共處理48 h)。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.3軟骨細(xì)胞mRNA表達(dá)的檢測(cè)

1.3.1細(xì)胞總RNA提取:向六孔板各孔中加入1 ml trizol，轉(zhuǎn)移至EP管中，加入200 ml氯仿，振蕩15 s，冰上靜置10 min。4℃離心(16 113×g，15 min)，取上清。然后加入與上清體積相等的異丙醇，混勻，靜置10 min。4℃離心(16 113×g，10 min)，棄上清。加入1 ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃離心(11 190×g，5 min)，棄上清。晾干，加入30 ml雙蒸水溶解。60℃促溶15 min。在測(cè)定A260/A280值后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.3.2RT-PCR反應(yīng)：引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為20 ml，采用ΔΔCt法分析結(jié)果。

表1 RT-PCR引物序列及退火溫度

注：ABCA1為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1，ABCG1為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1，Aggrecan為蛋白聚糖，Col2a1為Ⅱ型膠原前體α1，LXRα為肝臟X受體α，MMP-13為基質(zhì)金屬蛋白酶-13

1.3.3軟骨細(xì)胞TCH含量：采用組織TCH含量酶學(xué)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。通過(guò)消化和離心收集細(xì)胞，并將0.2 ml裂解液加入各孔中，混勻后室溫下靜置10 min。勻漿液離心(2000×g，5 min),取200 μl上清，加入玻璃試管，再加入測(cè)定試劑均勻混合，在37℃條件下孵育20 min。測(cè)定時(shí)先用蒸餾水管為空白管校零，隨后即可測(cè)定各樣本OD 500吸光度值，并根據(jù)試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算各樣本濃度。

2 結(jié)果

2.1大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成及降解功能 在IL-1β誘導(dǎo)OA模型方面，首先檢測(cè)了軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原前體α1(α1 of collagen typeⅡ， Col2a1)、蛋白聚糖(Aggrecan)和基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase 13， MMP-13)的mRNA表達(dá)變化。與對(duì)照組相比，模型組5、25、125 μmol/L組Col2a1和Aggrecan的mRNA表達(dá)均顯著降低，而MMP-13的mRNA表達(dá)則顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，僅125 μmol/L組Col2a1和Aggrecan的mRNA表達(dá)顯著降低，MMP-13的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 25-羥基膽固醇對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成及降解功能的影響

對(duì)照組為正常細(xì)胞不予處理，模型組為用20 ng/ml IL-1β處理48 h制備骨關(guān)節(jié)炎模型，5、25、125 μmol/L組分別給予不同濃度25-羥基膽固醇處理；IL-1β為白介素-1β；Col2a1為Ⅱ型膠原前體α1，Aggrecan為蛋白聚糖，MMP-13為基質(zhì)金屬蛋白酶-13；與對(duì)照組比較，aP<0.05;與模型組比較，cP<0.05

2.2對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞膽固醇流出通路的影響 在此模型上，進(jìn)一步檢測(cè)了軟骨細(xì)胞膽固醇流出通路肝臟X受體α(liver X receptor α， LXRα)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1， ABCA1)和ABCG1的mRNA表達(dá)變化。與對(duì)照組比較，模型組及25、125 μmol/L組LXRα的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而模型組及5、25 μmol/L組ABCA1和ABCG1的mRNA表達(dá)則無(wú)明顯改變(P>0.05)。與模型組比較，125 μmol/L組LXRα、ABCA1和ABCG1的mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 25-羥基膽固醇對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞膽固醇流出通路的影響

對(duì)照組為正常細(xì)胞不予處理，模型組用20 ng/ml IL-1β處理48 h制備骨關(guān)節(jié)炎模型，5、25、125 μmol/L組分別給予不同濃度25-羥基膽固醇處理；IL-1β為白介素-1β；LXRα為肝臟X受體α，ABCA1和ABCG1為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1和G1；與對(duì)照組比較，aP<0.05;與模型組比較，cP<0.05

2.3對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TCH含量的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TCH含量無(wú)明顯變化(P>0.05)；當(dāng)給予125 μmol/L 25-羥基膽固醇后，軟骨細(xì)胞TCH含量較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討論

越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始認(rèn)為OA的發(fā)病可能是源于全身代謝異常，而不是僅僅因?yàn)殛P(guān)節(jié)局部的病理改變所致。尤其是脂代謝紊亂與OA的發(fā)生存在著密不可分的關(guān)系[9-10]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，家族性高膽固醇血癥患者發(fā)生手部OA風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，其患者關(guān)節(jié)內(nèi)可見(jiàn)明顯的膽固醇沉積[11]。雖然膽固醇對(duì)細(xì)胞的活性及功能是一種不可缺少的物質(zhì)，但細(xì)胞內(nèi)膽固醇的大量蓄積將會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積導(dǎo)致的損傷，必將影響軟骨細(xì)胞基質(zhì)的合成與分泌，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨質(zhì)量的降低[7]。已知細(xì)胞內(nèi)膽固醇沉積可通過(guò)與脂肪酰基的作用，影響細(xì)胞膜流動(dòng)性，并破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。正常情況下，膽固醇是軟骨細(xì)胞所必需的營(yíng)養(yǎng)成分，但是在某些病理情況下軟骨細(xì)胞內(nèi)膽固醇的異常蓄積可導(dǎo)致OA發(fā)生[13]。Tsezou等[8]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OA患者軟骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量較正常人軟骨細(xì)胞顯著升高。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在給予25-羥基膽固醇后，正常成人軟骨細(xì)胞Col2a1的mRNA表達(dá)降低[7]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，給予125 μmol/L 25-羥基膽固醇可導(dǎo)致OA軟骨細(xì)胞Col2a1和Aggrecan的mRNA表達(dá)減低，且MMP-13的mRNA表達(dá)升高，且TCH含量明顯增加。提示膽固醇蓄積可影響軟骨細(xì)胞的基質(zhì)合成和降解功能，從而導(dǎo)致軟骨質(zhì)量降低。

圖3 25-羥基膽固醇對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TCH含量的影響

對(duì)照組為正常細(xì)胞不予處理，模型組用20 ng/ml IL-1β處理48 h制備骨關(guān)節(jié)炎模型，125 μmol/L組給予25-羥基膽固醇處理；IL-1β為白介素-1β；TCH為總膽固醇；與對(duì)照組比較，aP<0.05

由于胞內(nèi)膽固醇的蓄積可導(dǎo)致細(xì)胞功能損傷，所以大部分細(xì)胞都有著嚴(yán)格的膽固醇流入、流出系統(tǒng)，以防止胞內(nèi)膽固醇蓄積[14]。在外周組織，細(xì)胞內(nèi)的膽固醇主要依靠跨膜整合蛋白ABCA1或ABCG1轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，而后通過(guò)血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至肝臟，該過(guò)程受到LXR等多種因子調(diào)節(jié)[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，OA軟骨細(xì)胞存在細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，同時(shí)細(xì)胞膽固醇流出系統(tǒng)相關(guān)基因ApoA1及LXR表達(dá)降低，且LXR激動(dòng)劑TO-901317可顯著性增強(qiáng)ApoA1和ABCA1基因表達(dá)，明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出和改善細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積[8,17]。因此，膽固醇流出系統(tǒng)的改變可能是導(dǎo)致OA發(fā)生的因素之一，而LXR在軟骨細(xì)胞膽固醇流出系統(tǒng)中扮演著重要角色。但目前仍未有直接證據(jù)報(bào)道，高膽固醇血癥是否可通過(guò)抑制軟骨膽固醇流出通路，從而進(jìn)一步加重軟骨膽固醇蓄積。我們的結(jié)果顯示，125 μmol/L 25-羥基膽固醇可導(dǎo)致大鼠OA軟骨細(xì)胞膽固醇流出通路相關(guān)基因LXRα、ABCA1和ABCG1的mRNA表達(dá)顯著降低。提示膽固醇可能通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞LXRα/ABCA1/ABCG1通路，影響軟骨細(xì)胞膽固醇流出系統(tǒng)，從而進(jìn)一步導(dǎo)致軟骨細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積。流行病學(xué)資料表明，他汀類降脂藥物可有效改善膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生與進(jìn)展[18]。這可能與其通過(guò)改善軟骨局部膽固醇蓄積有關(guān)。

綜上所述，膽固醇在OA的發(fā)生、發(fā)展中占有重要地位，其可能通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞膽固醇流出通路，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積，最終引起軟骨細(xì)胞質(zhì)量降低，加重OA發(fā)展進(jìn)程。本研究有助于我們?nèi)嬲J(rèn)識(shí)膽固醇代謝與OA二者之間的關(guān)系，對(duì)OA的早期預(yù)防和治療方案的選擇起到了指導(dǎo)作用。