標本混勻方式對血清生化檢測結果的影響

余 超，李明伊，車翔林

(1.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院檢驗科,湖北武漢 430022；2.華中科技大學同濟醫學院，湖北武漢 430030)

臨床實驗室中的錯誤主要來源于分析前誤差，分析前誤差可能導致結果不準確甚至系統性偏倚。分析前階段包含樣本的處理和保存相關作用。為保持樣本的最佳性能，冷凍樣本最好解凍1次。解凍循環次數、保存溫度已有研究[1-2]，近來也有報道了混勻對保存溫度的影響[3],但解凍時間及解凍后的充分混勻描述模糊。HAWKER等[4]研究了自動解凍與混勻裝置對生化檢測結果的影響，而常規混勻方式的研究主要用于血液混勻[5]。不同混勻方式對抗凝血樣本的影響也有報道[6]。在我國，手動顛倒混勻是實驗室的主要方式，目前沒有相關的研究。盡管分析前階段無法形成標準化，但能同質化[7]。因此，本文通過對凍存樣本解凍時間、混勻方式、手動顛倒混勻次數進行研究，為同質化提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集同日100例已檢測后無肉眼可見溶血、脂血、黃疸門診患者血清樣本，充分混合混勻后按每個EP管0.5 mL進行分裝，共400個EP管。

1.2儀器與試劑 漩渦混勻器(海門其林貝爾)，滾筒式混勻器(江蘇康健)，分析儀器采用美國雅培(Abbott)公司的c16000全自動生化分析儀。試劑：清蛋白(ALB)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、尿素氮(BUN)、膽固醇(CHOL)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、鉀(K+)、鈉(Na+)、總膽紅素(TBIL)、三酰甘油(TG)、超敏C-反應蛋白(hs-CRP)的檢測試劑均為雅培原裝配套試劑。校準品：雅培原裝配套校準品。質控品：伯樂公司提供。

1.3方法 生化分析儀每日質控在控后，隨機選取5個已分裝的EP管上機檢測上述項目，檢測結果均值作為基線。將余下EP管放置于塑料泡沫板上，于-20 ℃冰箱冷凍過夜保存。次日，取出10個EP管懸置于架子上，靜置于室溫(24 ℃)無明顯空氣流動下，以冰晶消失為終點，觀察融解所需時間。取20個EP管平均分成4份，1份垂直放置，余3份水平放置，解凍1 h后，取水平放置中的1份用漩渦混勻器混勻30s，1份用滾筒式混勻器以50 r/min混勻5 min，余兩份不混勻上機檢測，并重復檢測一次。取240個EP管水平放置解凍1 h后，由20名實驗人員手動顛倒混勻2、4、6、8、10、20次后檢測，并重復一次。取60個EP管垂直放置解凍1 h后，由5名實驗人員手動顛倒混勻2、4、6、8、10、20次后檢測，并重復一次。取12個EP管以觀察解凍所需最少時間按水平和垂直放置后由1名實驗人員手動顛倒混勻2、4、6、8、10、20次后檢測，并重復一次。

1.4統計學處理 數據采用SPSS19.0統計軟件處理，采用配對t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1以冰晶消失為終點，0.5 mL冰凍血清解凍所需時間約17～23 min。因此，選擇25 min能確保解凍完全。

2.2不同混勻方式的比較 以臨床檢測項目允許總誤差TEa的1/3作為判斷標準[8]，計算偏倚Bias。漩渦與滾筒混勻除ALT差異有統計學意義(P<0.05)但無臨床差異外其他項目差異均無統計學意義(P>0.05)及臨床差異；未混勻臨床差異不可接受。見表1。

2.3水平放置下不同人員間手動顛倒混勻的比較 不同人員在顛倒混勻2次后，僅ALB有統計學差異(P=0.049)。此組內ALB的生物學變異偏倚范圍是-2.3%～1.2%，又因|-2.3%|>2%[8]，故有臨床差異?；靹?次及以上無統計學(P>0.05)及臨床差異。見表2。

2.4垂直放置下不同人員間手動顛倒混勻的比較 不同人員顛倒混勻2次后，ALB(P=0.007)、CHOL(P=0.019)、K+(P=0.029)、Na+(P=0.023)、TRIG(P=0.006)檢測結果差異有統計學意義；混勻8次后，hsCRP差異有統計學意義(P=0.015)；混勻10次后，AST差異有統計學意義(P=0.030)；令人吃驚的是，TRIG除了在混勻10次時無統計學意義外，其他差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 不同混勻方式偏倚的比較(%)

表2 水平放置顛倒混勻次數與漩渦混勻的偏倚比較(%)

注：配對t檢驗，以*表示P<0.05。

表3 垂直放置顛倒混勻次數與漩渦混勻的比較(%)

注：配對t檢驗，以*表示P<0.05。

2.5垂直放置下不同人員間手動顛倒混勻的臨床差異偏倚比較 對上述有統計學差異的項目進行臨床差異偏倚比較的結果表明：混勻2次，ALB(|-2.80%|>2.00%)、CHOL(|-3.10%|>3.00%)、Na+(|-2.00%|>1.33%)的臨床差異仍然存在，而K+(|-1.70%|<2.00%)及TRIG(|-3.10%|<4.67%)的臨床差異可接受。混勻2次以上，hsCRP(2.40%<10.00%)、AST(3.70%<5.00%)、TRIG(|-1.50%|<4.67%)的臨床差異均可接受。見表4。

表4 臨床差異偏倚比較(%)

注：minB為批內最小值的偏倚;maxB為批內最大值的偏倚；BC為偏倚判斷標準；Y表示有差異，N表示無差異。

2.6解凍25 min對生化結果影響的比較 解凍時間從1小時縮短至25 min，水平放置樣本顛倒混勻2次后，僅發現TRIG(P=0.013)差異有統計學意義但無臨床差異TG(0.8%<4.67%)；垂直放置時，AST(P=0.043)和TRIG(P=0.022)有統計學差異但無臨床差異AST(3.70%<5.00%)和TRIG(0.80%<4.67%)。見表5、6。

表5 水平放置解凍25 min顛倒混勻次數與漩渦混勻的比較(%)

注：配對t檢驗，以*表示P<0.05。

表6 垂直放置解凍25 min顛倒混勻與漩渦混勻的偏倚均值比較(%)

注：配對t檢驗，以*表示P<0.05。

3 討 論

混勻是分析前的一個重要環節，如標本采集后的混勻對溶血和檢測的影響[9]，解凍血漿混勻不充分可能導致VWD或血友病的誤診[10]。凍存樣本檢測前均需要充分混勻，質控品解凍后也需充分混勻[11]，但均未說明混勻方式。漩渦混勻[3]常用于科學研究長期冰凍保存的樣本，滾筒混勻[5]在血液混勻更常見。表1結果表明這兩種混勻方式都能達到充分混勻的目的。而無論是水平或是垂直放置未混勻樣本結果偏差大，臨床不可接受。水平放置的差異小于垂直的差異在于從水平到垂直過程使血清的流動而部分混合，也由于解凍后的血清會形成自上而下逐漸增加的一系列的濃度梯度。出現此種現象的機制尚不明確，可能是由于冰凍時水將最先凍結且密度變低，導致血清中其他成分如蛋白質以及鹽類等沉積在容器的底部[2]。也可能是來自冷凍材料的血清成分是選擇性可溶的，留下冰粒，使血清上部組分稀釋而血清下部成分的濃縮。盡管機制仍不明朗，但說明冰凍血清解凍后呈不均一狀態，檢測前務必充分混勻。

然而，與上述兩種機械混勻方式相比，手動顛倒混勻在全國的臨床實驗室更為常見。LIPPI[12]報道了不同操作人員對手動移液器使用間的差異，同樣不同檢驗員混勻的手法和力度及顛倒次數不同，也存在人員間的差異。表2結果可知，不同人員在顛倒混勻2次后，部分項目的統計學差異和臨床允許范圍不可接受。這與HAWKER等[4]對自動機械化混勻裝置的研究結果混勻2次即可充分混勻不相符。因自動化混勻裝置能精確控制顛倒的弧度和力量，而人則不能。但不同人員混勻4次及以上，臨床可接受且接近2次，說明顛倒與機械混勻差異不明顯。選擇漩渦混勻值而非基線作為標準，是避免解凍標本影響檢測結果[2]及批間差異。

樣本冷凍保存時通常是垂直放置，解凍時也可能是垂直放置。與水平放置相比，垂直放置時有統計學差異的項目明顯增多且顛倒次數增加時也有存在?？赡苁且驗榍笆鏊降酱怪钡牟糠只旌希部赡苁卿鰷u等方式混勻比手動混勻更充分具有較高的精密度，從而存在有統計學意義但無臨床差異。因此，不同人員間手動顛倒混勻2次有差異，4次及以上則沒有差異。

樣本解凍時間至少大于1 h[4]，但實際工作中通常少于1 h。觀察0.5 mL冷凍標本以冰晶消失為終點表示完全融解所需時間約17～23 min，這與HAWKER[4]的研究最多需要23 min解凍并達到室溫吻合。不同的是，該作者的研究利用的吹風等設備使血清復溫到室溫，而本研究只解凍并沒有復溫。因為樣本加樣量是微量且遠小于試劑的加樣量，同時機上試劑保存低于8 ℃，樣本溫度與試劑溫度接近，不影響樣本性質。在解凍25 min條件下，對水平或垂直放置手動顛倒混勻次數研究發現，顛倒混勻4次及以上，可達到充分混勻狀態。因此，解凍時間縮短至25 min并不影響檢測性能，但能提高工作，優化效率。

本文研究的特色在于用患者血清樣本代替質控品，不僅節約了實驗成本，還適用于科研樣本及未及時檢測保存樣本的解凍及混勻，更具有代表性和實用性，可用于實驗室混勻的規范。其次，選擇檢測項目包含蛋白質類、酶類、代謝物類、脂類、電解質類，覆蓋范圍廣，且基本覆蓋了生化檢測的方法學類別[13]。再次，用臨床可接受范圍比統計學差異更符合生理特點。第四，考慮到了人員之間的差異，手動顛倒混勻4次可消除這種差異。最后是縮短解凍經驗時間，提前完成質控，保證工作質量同時提早工作進程，優化工作效率。然而本研究僅在解凍1 h水平放置狀態時做了人員間的比對，垂直放置及25 min條件下并未檢測，是因為前一實驗為后續實驗提供人員間差異消除的基礎。

4 結 論

凍存樣本解凍后必須充分混勻，解凍時間不少于25 min，不同的實驗人員對不同放置方式(水平或垂直)的冷凍樣本顛倒混勻4次可達到完全混勻的狀態。本實驗建立了凍存樣本解凍及混勻的一個統一方案，并為形成一套規范化操作規程提供研究基礎。