MALDI-TOF-MS檢測哈維弧菌前處理條件的探索及聚類分析*

武 靜，陳英劍，李繼霞，胡成進

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六○醫院實驗診斷科，山東濟南 250031)

哈維弧菌又稱哈氏弧菌，為革蘭陰性嗜鹽菌，是海水中重要的機會性致病菌，主要引起蝦及魚類和貝類的感染，引發死亡率較高的弧菌病[1-3]。據報道[4]，該菌可引起泰國、印度、澳大利亞、中國等地的斑節對蝦、墨吉明對蝦、長毛明對蝦等不同種類對蝦和魚類、貝類大量死亡，嚴重危害水產養殖業發展[5]。還可引起法國、日本、歐洲的鮑魚于2天內發生大批量死亡，產生巨大經濟損失。研究顯示[6]，不同弧菌對不同抗菌藥的敏感性不同，對弧菌病的診斷鑒定到種十分必要。因此，為快速診斷并有效治療哈維弧菌感染，急需一種快速、有效的檢測手段。

目前，我國國家標準中還沒有哈維弧菌的檢測方法。哈維弧菌的菌落無明顯特征，且鏡下形態與其他弧菌相似。VITEK-Compact是傳統微生物檢測方法中最常用的微生物鑒定儀器，而依據產品說明書，V2S 5.01細菌庫中GN卡僅能夠鑒定包括溶藻弧菌和副溶血性弧菌在內的8 種弧菌，未包含哈維弧菌。文獻報道的哈維弧菌檢測多是基因測序方法[7-9]。基因測序對于哈維弧菌的鑒定有明顯的優勢，但操作繁瑣，對操作人員技術要求高，操作時間長，不適宜常規開展。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)是近年發展起來的一種全新的用于微生物快速鑒定的技術，具有快速、穩定、準確、重復性好的特點。本研究基于MALDI-TOF-MS檢測哈維弧菌，對其前處理條件及聚類分析進行了探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑 哥倫比亞血瓊脂培養基、TCBS即硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養基、2216E培養基；α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)基質、50%乙腈、2.5%三氟乙酸。

1.1.2菌株來源 33株哈維弧菌，分布于中國黃渤海海域、美國及日本沿海區域，分離自患病的海洋動物及海水中。

1.1.3主要儀器 MALDI-TOF-MS(型號：布魯克autoflex speed)；靶板MSP 96 target polished steel；數據采集軟件flexControl3.4；數據分析軟件flexAnalyses3.4；結果鑒定軟件Biotyper3.1，該軟件自帶Biotyper3.1數據庫。恒溫培養箱(美國SHEL-LAB公司)；Ⅱ級生物安全柜(新加坡ESCO公司)，購自美國Baker公司。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取及rpoB測序 所有菌株接種在2216E培養基，28 ℃孵育箱恒溫培養24 h。無菌EP管中加入50 μL無菌水，挑取單個菌落，調制菌液至2濁度，震蕩混勻；置100 ℃沸水中煮沸10 min，冰上放置10 min；13 000 r/min離心5 min，上清液即為DNA提取液。取上述步驟提取的基因組DNA作為PCR反應模板，進行rpoB基因擴增。PCR 反應程序為預變性94 ℃ 8 min；循環94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s ，72 ℃ 1 min 30 s，30循環；72 ℃延伸8 min。反應引物F:AGG CGT GTT CTT CGA CAG CGA TAA，R:TCG TCC ACT TCG CCT TTA CC。擴增產物送英濰捷基(上海)貿易有限公司完成測序，利用NCBI中Blast軟件進行比對。

1.2.2細菌質譜鑒定 哈維弧菌接種于哥倫比亞血瓊脂培養基、TCBS瓊脂培養基和2216E培養基，37 ℃分別培養16、24、48 h后，同時采用兩種方法進行樣本前處理。直接涂抹法：在平板上挑取單個菌落均勻涂于靶板上，即刻在涂布的菌落上加入1 μL HCCA基質液覆蓋，在室溫下自然干燥后進行檢測，每個菌株重復檢測2次。甲酸提取法：在EP管中加入300 μL去離子水。取待測微生物樣本至離心管中。充分混勻。加入900 μL乙醇，13 000 r/min離心2 min，倒去上清。再次離心，使用移液槍完全去除殘余的上清，整個過程不應觸碰沉淀液。室溫下干燥沉淀2～3 min。加入70%甲酸水溶液(1～80 μL，根據生物量調整)，渦旋振蕩。加入純乙腈(1～80 μL，與甲酸等體積)，充分混勻。13 000 r/min離心2 min。吸取1 μL上清，滴加到MALDI靶板上。半小時內，用1 μL HCCA基質溶液覆蓋上述樣品點。

用flexControl3.4軟件采集圖譜，并用flexAnalyses3.4軟件對圖譜進行分析。根據所得圖譜與儀器數據庫參考圖譜匹配程度，用BioTyper3.1軟件可得到0～100的分值(對數值為1～3)。儀器參數為：線性操作、正離子模式；檢測范圍：(2～20)×103；激光點擊數：每圖譜50 shots；激光頻率：30.0 Hz；離子源加速電壓：20 kV。

1.2.3質譜聚類分析 利用Biotyper 3.1軟件的cluster analysis功能對33株菌進行聚類分析。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行分析。不同培養基、不同培養時間以及不同處理方法下“屬”“種”水平鑒定結果比較用χ2檢驗和Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1質譜圖及蛋白峰差異 將每株菌產生的所有峰經過歸一化處理、閾值設定、排除異常峰，挑選出60個峰進行分析。所有的實驗菌株在m/z為4 278、5 183、6 129、6 410、7 210附近均出現高強度蛋白峰。研究顯示[10-11]，質譜獨特蛋白峰型的存在可能是特異性蛋白或毒力性的標志，可能預測耐藥情況。這些種特異性蛋白峰，有可能成為哈維弧菌的分子標志物，尚需要進一步的研究去證實。

2.2不同培養基對哈維弧菌鑒定的影響 假設不同培養時間及不同前處理方法對不同培養基的鑒定結果無影響。本文僅列出了培養18 h甲酸提取法條件下的統計結果。哈維弧菌在哥倫比亞血瓊脂培養基、TCBS瓊脂培養基和2216E培養基中的培養鑒定結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同培養基鑒定結果比較[n(%)]

2.3不同培養時間對哈維弧菌鑒定的影響 不同培養基的選擇對鑒定結果無明顯影響，假設前處理方法的選擇對不同培養時間的鑒定結果無影響，本文僅對血平板甲酸提取法條件培養時間對鑒定結果的影響進行了探討。結果顯示，培養18、24 h的鑒定準確率，差異無統計學意義(P>0.05)。但培養48 h鑒定準確率明顯低于培養18、24 h的鑒定準確率，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同培養時間鑒定結果比較[n(%)]

2.4不同前處理方法對哈維弧菌鑒定的影響 選擇血平板、培養18 h條件下探討前處理方法的影響。甲酸提取法鑒定準確率明顯高于直接轉移法的鑒定準確率，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同前處理方法鑒定結果比較[n(%)]

2.5質譜聚類分析 見圖1。在距離水平為900的時候被分成了2支，其中一支用B表示，主要包括哈維弧菌20、21、22、25、26、27、29、30、31、32，該10株菌均分離自中國。其余歸為一支，用A表示。在距離水平為700左右時又被分為兩個分支，其中一支包括1、2、3、4、5、6、14、19、23、24、33共11株菌，該11株菌除3、19、24、33外其余均分離自美國。另一支包括7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、28，分離自西班牙、突尼西亞、厄瓜多爾、丹麥等多為歐洲地區。可見地理位置較近的菌株被歸為相同分支。

圖1 33株哈維弧菌MALDI-TOF-MS指紋圖譜聚類分析

3 討 論

16S rRNA序列分析為公認的細菌鑒定的金標準。然而由于海洋細菌基因序列高保守性和高同源性的特點，16S rRNA測序并不能對海洋弧菌進行可靠鑒定。編碼RNA聚合酶β亞基的基因rpoB，為序列較長的單拷貝基因，可以克服16S rRNA的高度保守性[12]。而且有研究已經證明rpoB基因，可用于弧菌的分類[13-14]。因此，本研究采用rpoB基因測序作為哈維弧菌鑒定的參考方法。

質譜鑒定是將細菌直接點在靶板上，通過激光照射使細菌電離，收集所產生離子的m/z及強度，與庫中已知菌株的蛋白指紋圖譜進行比較，得出鑒定結果。從涂菌到取得結果只需幾分鐘，具有快速、準確、高通量等明顯優勢。

不同的培養基和培養時間及前處理方法對細菌蛋白表達有一定影響，會造成質譜圖中峰點、峰信號強度、信噪比等的差異，得到不可靠的鑒定結果。因此，本研究針對哈維弧菌進行了質譜檢測前條件的摸索。不同菌種對培養基的適宜生長程度不同。有研究利用不同培養基分離純化食品中可疑沙門菌，結果發現不同培養基培養出的沙門菌用MALDI-TOF-MS鑒定出的菌種不同[15]。本研究中3種不同培養基培養鑒定分值沒有明顯差異，可能3種培養基均能滿足哈維弧菌的生長要求。但若菌落比較小難以挑取或取到培養基會顯著影響鑒定可信度。短時間培養的選擇(18、24 h)對鑒定結果的影響不明顯，可能因為對數生長期和穩定期核糖體蛋白比較穩定。長時間培養細菌生長進入衰亡期，蛋白表達受到抑制。同時考慮到對細菌鑒定快速性的要求，推薦使用對數生長期的菌落進行鑒定。直接轉移法為將細菌直接涂到靶板上后再點加基質進行分析，簡單、快速、重復性好，但結晶的均勻性較差。而甲酸提取法有細菌滅活和蛋白溶出的步驟，可改善結晶的均勻性。甲酸提取法中水和乙醇能洗掉培養基內的雜質，而甲酸能保護分析物質，避免分解。通過甲酸提取法前處理的細菌得到的質譜圖離子峰較多，信噪比更高。

有研究顯示[16-17]，不同海洋環境和地理位置會影響不同弧菌種和亞種的分布，同一菌的毒力和致病性也會隨著地理位置的不同而改變。本研究對不同時間不同地點分離的33株哈維弧菌菌株的聚類分析也證實MALDI-TOF-MS不僅可以分類細菌而且對于一些致病菌的溯源分析具有重要價值，符合病原菌流行病學分析快速、有效的要求。因此，對海洋弧菌病爆發流行時感染性病原體的溯源，質譜檢測將會發揮重要作用。

MALDI-TOF-MS數據庫中必須含有足夠多的已知菌株，才可實現匹配度最高的鑒定。利用本研究中的前處理條件，33株哈維弧菌已入庫。相信隨著數據庫的不斷補充,MALDI-TOF-MS在海洋漁業養殖業的應用會越來越廣泛。而且隨著儀器趨向體積小和成本低方向的發展，質譜儀將會更加適合推廣應用。

4 結 論

本研究提出了一種基于MALDI-TOF-MS快速檢測哈維弧菌的新技術，首次探討了前處理的適宜條件并對33株哈維弧菌進行了聚類分析，為海洋漁業哈維弧菌病的快速診斷及流行病學分析提供了理論依據。