15種高危型人乳頭瘤病毒核酸檢測方法驗證及人群感染情況調查*

王萌萌，孔凡虹，宗曾艷，，張水蘭，闞麗娟，湯花梅，張秀明，，熊 丹，△

(1.安徽理工大學醫學院，安徽淮南 232000；2.深圳大學第三附屬醫院醫學檢驗科，廣東深圳 518001)

人乳頭瘤病毒(HPV)是一種球形無包膜的環狀雙鏈DNA病毒，主要通過性傳播感染人皮膚和黏膜上皮。HPV感染易引發多種疾病，其中高危型HPV的持續感染是引起女性宮頸癌及癌前病變的主要原因；低危型HPV感染主要引起生殖器疣[1]。宮頸癌是世界上發病率位居第二的婦科腫瘤，僅次于乳腺癌。據調查，約99.7%的宮頸癌患者患有人乳頭瘤病毒(HPV)感染，因此，了解我國不同地域HPV基因型的分子流行病學概況，對HPV早期、快速、準確檢測和相關疾病的診斷與治療具有重要意義[2]。本研究依據CNAS-CL02：《醫學實驗室質量和能力認可準則》對醫學實驗室檢測系統性能評價的相關要求和CNAS-CL02-A009：《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》，CLSI-MM03和CNAS GL-039《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》等文件，對實時熒光定量PCR(qPCR)方法檢測HPV-DNA試劑盒的重復性、準確度、檢測下限和抗干擾能力進行評價，為使用該檢測方法的實驗室提供參考，并通過對深圳市羅湖區人民醫院婦產科HPV感染情況的調查分析，了解深圳羅湖地區HPV15種高危基因型別的分子流行病學特征，為宮頸病變的早期防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2019年4月在深圳市羅湖區人民醫院(下稱本院)婦產科就診的門診和住院女性患者剔除給藥后復查的檢測結果，共23 272例，年齡為11～73歲，中位數為34歲。納入標準：自愿進行宮頸篩查的女性；無宮頸手術治療史；近期未服用過抗生素或其他抗感染藥物。排除標準：用藥治療后復查患者；有子宮切除或宮頸病變史；有其他重癥疾病或癌癥的患者。按年齡分為5個年齡段，分別為≤25歲，26～35歲，36～45歲，46～55歲，≥56歲。

1.2儀器與試劑 上海之江Autrax192全自動核酸提取儀，上海宏石SLAN-96S熒光定量PCR儀，上海之江高危型HPV分型核酸測定試劑及其配套耗材。

1.3檢測方法 依據CLSI-MM03和《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》以及廠家試劑說明書對qPCR方法檢測HPV試劑進行重復性、準確度、最低檢出限、分析特異度，抗干擾能力性能驗證。并按照儀器和試劑盒操作SOP,對2018年6月至2019年4月在本院婦產科門診和住院就診的患者的宮頸脫落上皮細胞標本15種高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、62、68、82)檢測結果大樣本調查，根據廠家說明書判讀實驗結果。樣本Ct≤38，且擴增曲線呈典型的S型時，為陽性；Ct顯示“No Ct”時為陰性；Ct值在38～40之間，須重測，如仍在38～40之間，且擴增曲線呈典型的S型時為陽性；若呈非典型S型曲線則為陰性。若樣本在所有混合液中均為陰性；或樣本在混合液I(含IC)的通道Ct值>32或顯示“No Ct”，且在混合液I的其余通道以及其余混合液的各通道Ct欄都顯示“No Ct”，無法判斷結果，說明提取過程或PCR檢測存在問題，需重復試驗。

1.3.1重復性 對Autrax全自動核酸提取儀及SLAN-96S熒光定量PCR儀全面維護保養，確保儀器正常工作狀態。依據廣州邦德盛生物科技有限公司的《標準物質、第三方質控產品目錄手冊》中相關產品濃度換算，分別取1 例HPV16型強陽性樣本(20≤Ct≤26)(編號：HY，樣本類型為宮頸脫落上皮細胞)、1例 HPV58型臨界陽性樣本(31≤Ct≤36)(編號LY，樣本類型為宮頸脫落上皮細胞)和1例 HPV陰性(無擴增)樣本(編號：YX，樣本類型為宮頸脫落上皮細胞)，每次5個重復，分4批測定，共計20個數據，記錄每次檢測結果，如為陽性，則記錄相應亞型的Ct值。閾值設為默認值。根據相應陽性樣本的陽性型別Ct值，計算均值、SD值、CV值。計算4次實驗的總陰陽性符合率，依據CLSI-MM17A文件關于重復性指標要求，可知要求4次實驗的總陰陽性符合率均≥95.00% ，且每次實驗相應陽性樣本的陽性型別的Ct值的CV值≤5.00% 。

1.3.2準確度 通過分析本實驗室參加2018年衛生部臨床檢驗中心室間質評結果，從室間質評統計結果評價實驗室定性檢測結果的一致性，從而評價和驗證實驗室檢測結果的準確性。上海之江高危HPV試劑盒室間質評的樣本中僅涉及到HPV16、31、52以及低危型HPV6和陰性樣本的型別，故本實驗的室間質評通過檢測已知的這5個標準物質樣本，進行準確度評估。依據CLSI-MM17A和CNAS GL-039文件關于準確度指標要求可知，陰陽性符合率≥95.00%，則準確度符合要求。

1.3.3測定下限 檢測下限的實驗設計依據上海之江高危型HPV試劑盒說明書和《感染性疾病個體化醫學分子檢測技術指南》，具體方法取1例陽性對照品稀釋至Ct值約等于35(濃度約在10 000 copy/mL，廠家聲稱的檢測下限)進行10次擴增，記錄每次檢測結果，如為陽性，則記錄相應的Ct值。評判標準參考CNAS GL-039文件關于檢測下限的標準可知，10次擴增結果，檢測出的總陽性符合率均≥95%，則符合標準。

1.3.4分析特異度 分別選取約3×104copy/mL(Ct值為29～31)的HPV16型陽性樣品，HPV18型陽性樣品，HPV52型陽性樣品和HPV陰性的標本，加入包含HPV11型、HPV6型、HPV42型、HPV43型、HPV44型、HPV73型、HPV26型、HPV53型、沙眼衣原體、解脲支原體、淋球菌、人型支原體、生殖支原體、白色念珠菌、HIV-1和B 組鏈球菌的質粒，質粒濃度約5×106copy/mL，然后進行檢測，重復2次。參考CLSI-MM03和CNAS GL-039對于分析特異度評價標準，陰陽性符合率≥95% ，則結果符合標準。

1.3.5抗干擾能力

1.3.5.1抗交叉反應 上海之江公司提供一個包含HPV11、 6、42、43、44、73、26、53型、沙眼衣原體、解脲支原體、淋球菌、人型支原體、生殖支原體、白色念珠菌、HIV-1、B 組鏈球菌的質粒，質粒濃度約5×106copy/mL，分別加入到10例HPV分型陰性標本內，進行擴增。依據上海之江高危型HPV試劑盒說明書和CNAS GL-039標準要求10例HPV分型陰性標本的擴增結果，檢測出的總陰性符合率≥95%。

1.3.5.2內源性干擾 依據上海之江高危型HPV試劑盒說明書和《標準物質、第三方質控產品目錄手冊》取一份HPV16型陽性樣本分成4份，各300 μL，每份標本加入健康者的紅細胞0、6、10、12 μL的樣本進行提取，提取DNA后再進行復孔擴增，重復3次。依據CNAS GL-039標準，要求每個樣品的Ct值CV值均≤5%，并評判符合性。

1.4流行病學調查 對2018年6月至2019年4月本院婦產科送檢樣本,共23 272例，年齡11～73歲，按年齡分為5個年齡段，分別為≤25，26～35歲，36～45歲，46～55歲，≥56歲,進行調查分析。

1.5統計學處理 采用Excel與SPSS22.0軟件，通過χ2檢驗對本院2018年6月至2019年4月婦產科5個年齡組HPV感染的陽性檢出率進行統計與分析，P<0.05認為不同年齡段之間的HPV的感染率差異存在統計學意義。

2 結 果

2.1重復性 每次實驗的每個亞型的陰陽性符合率及4次實驗每個亞型總陰陽性符合率均為100%。每次實驗相應陽性樣本的陽性型別的Ct值的CV值均≤5%，見表1。該試劑批內及批間重復性良好，滿足臨床要求。

2.2準確度 5個樣本檢測的不同型別的HPV檢測結果和室間質評結果均一致，符合率為100%(5/5)，HPV基因分型檢測準確度符合要求。見表2。

表1 HPV-DNA 重復性驗證實驗結果

表2 HPV基因分型一致性比對結果

注：批次為2018年第11次室間質評實驗的5個樣本。

2.3測定下限 15種型別陽性10次測得均值均為陽性，陽性符合率為100.00%(10/10)，符合臨床檢測要求,見表3。

2.4分析特異度 加入干擾物之前后，同一樣本，同一型別的HPV檢測結果Ct值均值顯示，陽性結果(Ct≥38)和陰性結果(無Ct值)的符合率均為100.00%，符合臨床檢測要求。見表4。

2.5抗干擾能力

2.5.1抗交叉反應 10例HPV陰性標本加入干擾物前后擴增后檢測結果均為陰性，陰性符合率=100.00%(10/10)，表明無交叉反應，符合本實驗室要求。

2.5.2內源性干擾 當標本中紅細胞的濃度達到4.00%，每個樣品的Ct值CV值均≤5.00%，表示對檢驗結果依然沒有影響。說明當標本中紅細胞的濃度為4%，對檢測結果沒有干擾。

表3 測定下限實驗結果

表4 分析特異性實驗結果(Ct值)

2.6感染情況調查

2.6.1HPV感染總體情況及亞型結果 本次研究調查的23 272例15種HPV高危亞型就診女性當中，有4 601例感染HPV，感染率為19.77%，其中以單一亞型感染率高達3 443例，占總感染率的74.83%；多重感染有1 158例，占總感染率的25.17%。同時感染HPV基因型種類可高達7種亞型(HPV16、33、45、52、56、58、66型)。感染率居前5位亞型分別為HPV56(5.00%)、HPV58(3.00%)、HPV16(2.70%)、HPV51(2.30%)、HPV68(2.00%)。

2.6.2不同年齡段HPV感染及亞型分析 受檢者按年齡不同分為5組：≤25歲組、26～35歲組、36～45歲組、46～55歲組、≥56歲組。≤25歲組HPV感染率為28.70%(594/2 070)；26～35歲組HPV感染率為20.41%(1 468/7 192)；36～45歲組感染率為17.89%(2 364/13 211)，46～55歲組感染率為20.56%(133/647)，≥56歲組感染率為27.63%(42/152)，HPV總感染率在26歲以下最高，形成第一個高峰，隨之逐漸降低，在36～45歲達最低，在46～55歲有所抬高，各年齡組感染率成“U”形分布。見圖1。≥56歲組與≤25歲組和45～55歲組間的HPV總感染率比較差異無統計學意義(P>0.05),此外46～55歲組與26～35歲組以及36～45歲組之間的差異也沒有統計學差異(P>0.05)。其余兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各年齡組HPV總感染率分布

3 討 論

宮頸癌在女性腫瘤發病率中居第2位，是女性最常見的惡性腫瘤之一[3-5]。HPV感染是目前確認的宮頸癌發生的重要因素[6-7],幾乎所有的宮頸癌中均可檢測到HPV感染[8-9]。高危型HPV持續感染與宮頸癌發生密切相關，主要包括HPV16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82等型別[10-11]。因此，高危HPV檢測對宮頸癌篩查具有重要意義。新試劑和新項目引進之前需要進行性能驗證，本實驗室采用上海之江生物的Autrax192全自動核酸提取儀和上海宏石SLAN-96S熒光定量PCR儀，依據CNAS-CL02：《醫學實驗室質量和能力認可準則》，對醫學實驗室檢測系統性能評價的相關要求和CNAS-CL02-A009：《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》，CLSI-MM03，CLSI-MM17A和CNAS GL-039等文件，對上海之江HPV高危分型試劑盒的重復性、準確度、檢測下限和抗干擾能力進行了評估。研究結果顯示，HPV高危分型試劑盒每次實驗的每個亞型的陰陽性符合率及4次實驗每個亞型總陰陽性符合率均≥95.00% ，且每次實驗相應陽性樣本的陽性型別的Ct值的CV值均≤5.00%，參與室間質評結果符合率為100.00%，表明該試劑盒測定重復性和準確度良好，滿足臨床檢測要求。將1例陽性對照品稀釋至Ct值約等于35(濃度約在10 000 copy/mL，廠家聲稱的檢測下限)，重復性檢測，陽性檢出率為100.00%，符合臨床對臨界陽性標本的檢測要求。分別選取HPV16、HPV18、HPV52、HPV陰性標本，加入包含HPV11型、HPV6型、HPV42型、HPV43型、HPV44型、HPV73型、HPV26型、HPV53型、沙眼衣原體、解脲支原體、淋球菌、人型支原體、生殖支原體、白色念珠菌、HIV-1和B 組鏈球菌的質粒進行檢測，加入干擾物質后檢測的陰陽性符合率≥95.00%，檢測特異性良好，各型別之間及與其他微生物之間無交叉反應，符合臨床要求。當標本中紅細胞的濃度達到4.00%，對檢驗結果依然沒有影響，符合率100.00%，帶血標本對檢測無影響。說明該HPV高危分型試劑盒具有良好的重復性、準確度、檢測下限和抗干擾能力，可滿足臨床和科研對宮頸拭子的分析需求，并可廣泛使用于各等級醫院進行的HPV感染的早期篩查和大范圍使用。

婦產科就診患者為HPV的高發人群，本研究使用實時熒光定量PCR方法對2018年6-12月以及2019年1-4月本院婦產科送檢標本進行大樣本調查。結果顯示本院就診女性HPV感染率為19.77%，低于WANG等[12]對中國的HPV總感染率的調查，與江等對深圳福田地區HPV感染率調查相近，但遠高于江衛紅等[13]對福田區女性HPV 10.60%的感染率初步認為該差異是由收集病例群體和標本例數導致的。此外不同地區的HPV感染率也存在很大差異。如李軍等[14]對陜西地區HPV總感染率調查為32.14%，重慶地區HPV的總感染率為25.38%[15],福州地區為15.70%[16],可能與地域位置、當地經濟條件、生活習俗及人口遷徙等有關。筆者認為可能由于受調查人群，氣候條件，區域經濟衛生條件，生活習俗及人口遷徙因素影響。

本次調查顯示不同年齡段高危型HPV感染率呈“U”型分布，≤25和≥56歲HPV感染率最高，這與XUE等研究結果一致[17]，與朱丹玲等[18]報道的<30歲組HPV高危亞型感染率最低不同，可能與樣本調查量有關。在≤25是感染高峰期，可能是因為年輕女性宮頸發育不成熟，自身防御機能較差導致感染概率增高。隨后，在26～35歲開始下降，36～45歲HPV感染率降到最低，可能由于女性宮頸發育成熟，機體抵抗病毒能力力較強。46～55歲感染率開始上升直至56歲以上女性HPV感染率形成另一個高峰期，可能是絕經期激素變化引起的機體免疫系統功能紊亂，對病毒抵抗力降低，導致病毒的持續性感染或處于潛伏期的HPV被激活[19]。因此應該加強深圳羅湖地區≤25歲和≥50歲女性HPV篩查力度，以減低降低宮頸病變風險。本次調查結果顯示，深圳市羅湖區HPV高危型感染各年齡段高發的型別均為HPV56、HPV58、HPV16、HPV51、HPV68，故接種九價疫苗可有效預防宮頸癌發生。但針對本地區最常見的前5位高危亞型，九價疫苗僅涵蓋58、16型，而56、68、51型等則未涵蓋。因此通過了解我國不同地區的HPV的基因型感染情況，從而研發針對本國國情的多價疫苗，降低HPV的感染率具有重要意義。

4 結 論

本實驗室所用的HPV高危分型試劑盒具有良好的重復性、準確度、檢測下限和抗干擾能力，可滿足臨床和科研對宮頸拭子的分析需求，并可廣泛使用于各等級醫院。且通過對本地區HPV感染流行病學分析建議加大56歲以上的婦女HPV的篩查力度，普及26歲以下的婦女HPV九價疫苗注射。