龍爪果提取物的熱裂解產(chǎn)物分析及其應(yīng)用

侯亞龍， 錢 蕾， 毛璐伊， 夏永軍， 羅昌榮

（1. 上海牡丹香精香料有限公司，上海 201210；2. 上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

在煙草工業(yè)中，卷煙加香加料會用到各種果實類提取物[1-3]，這些提取物既可以豐富和增濃煙氣，又可以降低煙氣的刺激性和干燥感，使煙氣柔和細膩，掩蓋雜氣，對卷煙產(chǎn)品品質(zhì)的提升起到重要作用。

龍爪果，又名拐棗、枳椇，是落葉喬木枳椇果實中膨大的肉質(zhì)果梗，因其多分支且彎曲形似龍爪而得名。龍爪果甘甜無異味，在我國分布廣泛，陜西、湖北、廣東、浙江、江蘇等省主產(chǎn)，安全可食，果香濃郁，營養(yǎng)成分豐富[4-5]，也含有豐富的多酚、黃酮、多糖等功能性成分，具有抗炎、減脂、解酒保肝、抗氧化等[6-9]功效。目前，國內(nèi)對龍爪果梗的應(yīng)用主要集中在將其作為食品原料，用于加工果汁、果醋、果酒等功能型飲品和營養(yǎng)保健品[4,10-15]，在煙草方面的應(yīng)用未見報道。

龍爪果本身具有果甜香、草本香，與煙草風味協(xié)調(diào)，其還原糖（葡萄糖和果糖）、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機酸（蘋果酸、檸檬酸、富馬酸等）、維生素（維生素C、維生素B1、維生素B2、胡蘿卜素）含量均較高[5]。這些成分在煙支燃吸過程中可形成大量風味化合物，對提升煙草抽吸品質(zhì)有重要作用，因此具有作為煙草添加劑使用的基礎(chǔ)。

溶劑提取法是煙用香料提取的常用方法，該法簡單、易于工業(yè)化，過程控制容易，因此采用溶劑提取法來獲得龍爪果中可煙用的有效成分。

煙用香料的分析不同于普通的香精香料，其加入煙支后，需經(jīng)過高溫燃燒通過煙氣進入人體的感覺器官使消費者感知到，因此需通過模擬煙支燃燒條件，使龍爪果提取物高溫裂解，形成的裂解產(chǎn)物通過捕集裝置進行富集后，再通過一定方式釋放進入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行分析[16-17]。通過鑒定出來的化合物來了解龍爪果梗提取物可能對煙氣產(chǎn)生的影響，以便確定其在煙草產(chǎn)品中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料與試劑：龍爪果梗，產(chǎn)自陜西旬陽；乙醇95%，上海冠鴻化工有限公司；無水乙醇（優(yōu)級純）；玻璃棉（農(nóng)殘級）；石英棉（農(nóng)殘級）；

1.2 儀器與設(shè)備

RCT 合成套裝（3L 加熱套），德國IKA 公司；SL2000M 型頂置式攪拌器，德國Julabo 公司；飛鴿牌LXJ-Ⅱ型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；R-215 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi 公司；多功能反應(yīng)釜，德國Julabo 公司；CDS5250T 裂解儀，CDS Analytical Inc.；7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜儀，美國安捷倫科技公司；色譜柱：HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美國安捷倫科技公司；分析天平XPE205，梅特勒-托利多公司；電子天平PL6001E/02，梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 龍爪果梗提取液的制備

自然干燥的龍爪果梗，挑選飽滿無蟲蛀霉變的部分，稱取200 g，裝入3 000 mL 三口瓶中；按液固比7∶1，加入一定體積分數(shù)的乙醇使龍爪果梗充分潤濕；乙醇體積分數(shù)分別為0，15%，30%，50%，70%；安裝好溫度計、機械攪拌裝置和5 ℃回流冷凝裝置，轉(zhuǎn)速60 r/min 攪拌，加熱至沸后保持恒沸并計時，提取2 h 后停止加熱；經(jīng)250 μm孔徑篩網(wǎng)過濾除去果梗，濾液迅速冷卻至室溫，經(jīng)離心機2 000 r/min 離心10 min，取上清液，得到不同體積分數(shù)乙醇提取的提取液。將這些提取液經(jīng)旋蒸濃縮至相對密度為1.250±0.008，4 ℃冰箱保存，待用。

1.3.2 卷煙加料與感官評吸

1.3.2.1 卷煙加料

以煙絲重量的0.1%計算龍爪果提取濃縮液的添加量，按需取一定量樣品于10 mL 容量瓶中，用70%（體積分數(shù)）乙醇定容，搖勻備用。

取未加香加料的空白煙支，分為樣品組和空白對照組；樣品組按照龍爪果提取時的乙醇濃度分別進行編號，取該編號所對應(yīng)的龍爪果提取物稀釋液，用10 μL 注射器吸取5 μL 稀釋液，緩慢均勻地注入到整支煙中。空白對照組用同樣方法注入70%乙醇。

完成后將所有煙支放到恒溫[（22±1）℃]恒濕（相對濕度為60%±2%）箱中平衡48 h，待評吸。

1.3.2.2 感官評吸

采用拉丁方陣設(shè)計[18]確定每一個評吸員對已編號煙支的評吸順序，以有效避免評吸過程中會出現(xiàn)的“位置效應(yīng)”、“尾隨效應(yīng)”、“評吸員效應(yīng)”。

評吸結(jié)果采用暗評計分法，由6 名身體健康、經(jīng)驗豐富的優(yōu)選評吸員，在通風良好的專用評吸室內(nèi)互不干擾進行抽吸評價。每位評吸員將樣品煙與空白煙對比抽吸，按照評吸要求對各項指標進行計分。3 分表示樣品煙的感官指標與空白煙一致，高于3 分表示樣品煙的感官指標優(yōu)于空白煙，低于3 分則表示樣品煙的感官指標劣于空白煙，最高分為5 分，最低分為1 分，以此給出樣品煙的評價分數(shù)。

1.3.3 裂解氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析龍爪果提取液

1.3.3.1 試樣裝填

取裂解管，裝填1～2 mg 石英棉，在900 ℃下烘30 min 后，冷卻備用。使用5 μL 錐體頭進樣針取龍爪果70%醇提液2 μL 置于裂解管中的石英棉上，然后將裂解管放入裂解儀上待裂解。

1.3.3.2 裂解條件

裂解氣為氧氮混合氣（氧氣和氮氣按體積比9∶91 混合），氣體流量：70 mL/min；裂解儀閥箱溫度：280 ℃；裂解儀傳輸線溫度：280 ℃；冷阱捕集溫度：?60 ℃；冷阱系統(tǒng)：在去活不銹鋼管中間位置從兩端裝填約2 mg 玻璃棉；氣體流量計：量程0～1 000 mL/min，精確度±3%；裂解升溫程序：初始溫度300 ℃，保持5 s，以30 ℃/s 升至900 ℃，保持5 s。

裂解形成的產(chǎn)物經(jīng)氮氣吹掃進入冷阱，冷阱溫度在5 min 內(nèi)由?60 ℃升至280 ℃，進行脫附，同時進樣至氣相色譜，經(jīng)色譜柱分離后進入質(zhì)譜檢測。

每個樣品平行測試兩次；每測試一個樣品做一次空白。

1.3.3.3 色譜條件

色譜柱 HP-5MS（30 m × 250 μm × 0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度：280 ℃；載氣：高純氦氣（99.999%）；分流模式，分流比10∶1；柱流速1 mL/min；升溫程序：40 ℃保持3 min，然后 10 ℃/min 到240 ℃，然后20 ℃/min 到280 ℃保持5 min。

1.3.3.4 MS 采集參數(shù)

電子轟擊（EI）離子源；電離能量：70 eV；接口溫度：280 ℃；全掃描質(zhì)量數(shù)范圍：29～450；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃。

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1.3.3.5 定性及半定量方法

采用質(zhì)譜譜庫NIST11，Wiley275 進行檢索定性，匹配度大于70%的化合物保留；峰面積歸一化法進行裂解產(chǎn)物的半定量分析。峰面積歸一化百分含量按下式進行計算：

式中：Xi為某熱裂解產(chǎn)物的峰面積歸一化百分含量；Mi為某熱裂解產(chǎn)物的峰面積；為全部熱裂解產(chǎn)物總峰面積。

1.3.4 Maillard 反應(yīng)

龍爪果70%醇提濃縮物100 g，復(fù)配氨基酸41 g，葡萄糖59 g，去離子水100 mL，放入反應(yīng)釜中，安裝回流冷凝裝置，機械攪拌100 r/min，加熱至反應(yīng)液內(nèi)部溫度100 ℃，保持2 h。反應(yīng)結(jié)束，迅速冷卻，產(chǎn)物4 ℃保存，待評吸。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體積分數(shù)乙醇提取的龍爪果提取物感官評價

按照方法1.3.2.1 將不同體積分數(shù)乙醇提取得到的提取濃縮物添加至煙支中，依據(jù)1.3.2.2 方法進行評吸，結(jié)果見表1。

從表1 可以看出70%醇提物的抽吸效果最佳，可提升香氣質(zhì)和香氣量，使煙氣濃度提高并且更細膩柔和，降低煙氣刺激性和干燥感，改善余味。乙醇體積分數(shù)低于50%時，所得提取物在加料抽吸時表現(xiàn)為刺激性較大、干燥感較明顯，這兩項的得分較低。這主要是因為蛋白質(zhì)、果膠、淀粉等分子量大的物質(zhì)隨著乙醇體積分數(shù)的提高溶解度大幅下降，因此70%醇提取物中這類大分子物質(zhì)含量極低。蛋白質(zhì)在高溫燃吸時會形成羽毛燒焦的臭味并且會產(chǎn)生苦澀辛辣的感覺，果膠熱解則產(chǎn)生甲醇，對煙氣吸味不利[19-20]。因此，蛋白質(zhì)、果膠等的減少可以降低煙氣的刺激性、余味改善。而70%乙醇并未顯著影響糖、氨基酸、小肽、維生素、小分子有機酸等對煙氣有貢獻成分的溶出，且可以增加萜烯類、烷醇類、雜環(huán)類、有機酸類等風味化合物的溶出，有助于提升煙氣的香氣質(zhì)和香氣量。醇提也可使多酚和黃酮類物質(zhì)的溶出增大，這些物質(zhì)可以起到抗氧化、清除自由基等作用，降低煙氣的危害性。如果采用更高體積分數(shù)乙醇提取的話，則會顯著影響糖、氨基酸等物質(zhì)的溶出，使得提取液中的有效煙用成分大大降低，因此龍爪果70%醇提物對卷煙的抽吸效果改善最明顯。

表 1 不同體積分數(shù)乙醇提取物感官評吸結(jié)果Tab.1 Results of sensory evaluation of extracts from ethanol solvents with different volume fraction

2.2 龍爪果70%醇提物的裂解產(chǎn)物分析

煙用原料的分析常采用裂解分析，在裂解儀中通過控制氧氮比、氣體流速、裂解升溫程序等模擬煙支燃燒時的條件，并將裂解后形成的揮發(fā)性產(chǎn)物進行捕集。常用的捕集方式有冷阱捕集、吸附劑吸附（如固相微萃取）等。冷阱捕集的效果要優(yōu)于吸附劑，這是由于在?60 ℃的低溫條件下，揮發(fā)性組分可以全部冷凝下來，而吸附劑由于其所具有的選擇性，不能使全部組分被吸附。因此本研究采用?60 ℃冷阱捕集裂解產(chǎn)物，并在5 min內(nèi)快速升溫至280 ℃，使這些產(chǎn)物汽化進入氣相色譜。

圖 1 龍爪果70%醇提物的熱裂解產(chǎn)物總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of pyrolysis products of 70%ethanol extract of Hovenia dulcis fruit

從表2 可知，龍爪果70%醇提液裂解后形成的揮發(fā)性產(chǎn)物中能被鑒定出的化合物占84.13%，按照相對百分含量從高到低依次為：有機酸類26.68%、呋喃類15.79%、吡喃類7.75%、醇類12.33%、酮類9.56%、吡咯類4.78%、芳香族化合物1.64%、酯類1.49%、醛類1.39%、醚類1.12%。

檢出的有機酸類包括甲酸、乙酸、丙酸等小分子有機酸和棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸等高級脂肪酸，這些有機酸類物質(zhì)在卷煙煙氣中自然存在，對卷煙的香味、吃味、余味均有影響。小分子酸與煙氣的刺激性顯著相關(guān)，含量適中時可使煙氣有勁頭，但過高則使煙氣刺激性提高，高級脂肪酸類可中和游離煙堿，調(diào)節(jié)煙氣pH 值，降低煙氣刺激性，使煙氣醇和適口，量過高則會使煙氣有脂蠟味[21-22]。

呋喃類化合物中的糠醛、糠醇、5-甲基糠醛是卷煙主流煙氣中重要的風味物質(zhì)[23]；吡喃類化合物中占比最大的2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮可使卷煙的香氣質(zhì)有一定的改善，香氣量有明顯提升[24]；吡咯類化合物中甲基吡咯、2-吡咯烷酮都是卷煙主流煙氣的重要成分，其形成與脯氨酸有關(guān)[25]；醇類化合物中占比最大的甘油是卷煙工業(yè)中常用的保潤劑，2,3-丁二醇也具有保濕作用；酮類化合物中含量最大的2,3-己二酮具有甜的奶油、焦糖、水果氣味，可使煙氣豐富；醛類化合物僅檢出壬醛，該化合物具有玫瑰、柑橘等香氣；酯類化合物的含量較低；芳香族化合物中的2-羥基-5-甲基-苯乙酮是煙草香料的一種，3,4-二甲氧基苯酚具有甜香、木香、藥香、煙熏香，可使煙氣豐富，掩蓋雜氣。

表 2 龍爪果70%醇提物的熱裂解產(chǎn)物Tab.2 Pyrolysis products of 70% ethanol extract of Hovenia dulcis fruit

續(xù)表 2

從70%醇提龍爪果的裂解產(chǎn)物來看，其在燃吸條件下形成的化合物有些本身存在于卷煙煙氣中，大部分都有致香作用，與卷煙煙氣協(xié)調(diào)，可提升煙氣的香氣質(zhì)和香氣量，增濃和豐富煙氣，降低煙氣刺激性，改善吃味，且產(chǎn)物中未見其他一些天然提取物裂解時會出現(xiàn)的有害的稠環(huán)芳烴類化合物，因此說明龍爪果70%醇提物適合用于卷煙產(chǎn)品中，可進一步開發(fā)利用。

2.3 Maillard 反應(yīng)

含水率57.6%的新鮮龍爪果中還原糖含量可達18%以上，氨基酸種類豐富，含量在7 mg/g 以上[4]，可作為Maillard 反應(yīng)型香料的原料，通過氨基酸和還原糖的合理搭配，使得反應(yīng)產(chǎn)物的加香效果更優(yōu)于原來的提取物。

依據(jù)方法1.3.4 進行Maillard 反應(yīng)，得到龍爪果70%醇提物的Maillard 產(chǎn)物，按照方法1.3.2.1進行卷煙加料，并按1.3.2.2 進行感官評價，結(jié)果見表3。

從表3 可以看出，龍爪果70%醇提物的Maillard產(chǎn)物評吸效果優(yōu)于其醇提物，反應(yīng)產(chǎn)物在提升卷煙的香氣質(zhì)、香氣量，提升煙氣濃度，使煙氣更細膩、降低煙氣刺激性、產(chǎn)生回甜等方面優(yōu)于醇提物，可以更好地改善抽吸效果。該Maillard 反應(yīng)產(chǎn)物可用于梗絲、薄片、低次煙葉的提質(zhì)，以及降焦減害卷煙產(chǎn)品的增香提質(zhì)。

表 3 龍爪果70%醇提物及其Maillard 反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)用評價比較Tab.3 Evaluation and comparison of 70% alcohol extract of Hovenia dulcis fruit and its Maillard reaction products

3 結(jié) 論

龍爪果70%醇提物的裂解產(chǎn)物中含有大量可改善卷煙抽吸效果的風味化合物，其中主要是有機酸類化合物26.68%、呋喃類化合物15.79%、吡喃類化合物7.75%、醇類化合物12.33%、酮類化合物9.56%、吡咯類化合物4.78%、芳香族化合物1.64%、酯類化合物1.49%、醛類化合物1.39%，且其裂解產(chǎn)物中未見天然提取物中常見的有害稠環(huán)芳烴類化合物，說明該提取物適用于卷煙工業(yè)。為了進一步提高該提取物在卷煙中的應(yīng)用效果，以其為原料進行Maillard 反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物的加香效果更佳，有利于其在卷煙工業(yè)中的推廣使用。