兩種乳桿菌對高脂小鼠降血脂作用的研究

黃文麗， 夏永軍， 熊智強， 張 匯， 艾連中， 王光強

（上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程技術研究中心，上海 200093）

高血脂癥通常表現為血漿中血清總膽固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycerides, TG）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoproteincholesterol, LDL-C）中的至少有一項指標濃度過高，而高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoproteincholesterol, HDL-C）卻濃度過低[1]。血液中膽固醇水平過高早已被確認是冠狀動脈粥樣硬化心臟?。–HD）的獨立危險因素[2]。研究表明：人體血清膽固醇水平每高于正常值1 mmol/L，冠心病發病風險就增加35%左右；但是其含量每降低1%，發生冠心病的危險性可降低2%～3%[3]。因此，降低血清膽固醇水平對預防心血管疾病至關重要。目前控制和降低血脂水平主要采用藥物治療和飲食干預的方法，大部分藥物初期服用階段控制血脂效果顯著，但長期服用會產生不同程度的副作用及依賴性，加重患者健康問題[4]。飲食控制雖然能夠在一段時間內起到調節機體內脂質代謝的作用，但往往長期效果欠佳且稍不注意還易反彈。相比之下，食用降血脂功能性食品可能是長期控制血脂更理想的方法[5]。其中被公認的機制之一為通過益生菌產生膽鹽水解酶（bile salt hydrolase, BSH）將腸腔內的結合型膽酸水解成游離型膽酸，游離型膽酸不易被小腸吸收，大部分隨糞便排出體外，抑制了腸道膽汁酸的重吸收[6]，為了保證膽汁酸內穩態平衡，血清中膽固醇被用于合成新的膽汁酸以彌補隨糞便排出的膽汁酸部分，因此降低了血清膽固醇濃度[7]。

本實驗采用實驗室現有體外實驗水解膽鹽能力較強的 植物乳桿菌Lactobacillus plantarumAR113l和水解膽鹽能力較差的干酪乳桿菌Lactobacillus caseiLC2W 對高脂模型小鼠降膽固醇效果進行初步探究，以期為進一步開發降血脂功能性食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

植物乳桿菌編號AR113，分離自泡菜，實驗室保藏；干酪乳桿菌編號LC2W，實驗室保藏。

實驗動物及飼料：ICR（雄性）小鼠30 只，體質量18±2 g，購于上海杰思捷實驗動物有限公司。輻照無菌的基礎飼料與高脂飼料購自江蘇省協同醫藥生物工程有限公司。

基礎飼料組成見表1。高脂飼料組成：基礎飼料83.7%、豬油10%、蔗糖5%、膽固醇1%、膽鹽0.3%[8]。TC，TG，HDL-C，LDL-C 測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；其他化學試劑均為分析純。

表 1 基礎飼料配方[8]Tab.1 Composition of experimental diet

液體MRS 培養基：牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀0.2 g、硫酸錳 0.025 g、乙酸鈉0.5 g、檸檬酸氫二銨0.2 g、硫酸鎂0.058 g、吐溫?80 mL。用蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。固體MRS 培養基：在液體MRS 培養基中按2%的配比加入瓊脂粉，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

厭氧培養箱Bugbox，英國Ruskinn；多功能酶標儀SpectraMax i3x，奧地利Molecular Devices；HVE/HVA 系列高壓蒸汽滅菌鍋，日本Hirayama；超凈工作臺SW-CJ-IFD，蘇州凈化設備有限公司；動物天平，上海豪晟科學儀器有限公司；超低溫冰箱RevcoTM，美國Thermo Scientific。

1.3 方法

1.3.1 灌胃液制備

將保藏的植物乳桿菌AR113 與干酪乳桿菌LC2W 活化3 代后按3%的量接種到液體MRS 培養基中，37 ℃厭氧培養12 h 后，4 000×g 離心10 min收集菌體，用滅菌生理鹽水離心洗滌兩次，再用生理鹽水混勻，混勻后涂布于固體MRS 培養基上進行活菌數確認，調整菌液濃度為1.0×109CFU/mL，用于小鼠灌胃實驗。

圖 1 小鼠飼養流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of mice feeding

1.3.2 動物分組及飼喂方式

30 只ICR 小鼠喂食普通飼料適應性飼養1 星期后，按組間體重無顯著差異隨機分為4 組，對照組9 只喂食基礎飼料，高脂模型組9 只及其余兩組各6 只喂食高脂飼料。喂食高脂飼料4 星期后驗證高脂模型是否建成。高脂模型建立后，每星期稱1 次體重并調整灌胃量，每天上午按表2所示方式進行灌胃，按1 mL/100 g 灌胃量進行。試驗期間小鼠自由飲水，保持動物房通風、清潔和透光，維持室溫在22 ± 1 ℃。

表 2 小鼠分組及飼養方案Tab.2 Mice Grouping and feeding schedules

1.3.3 小鼠高血脂模型的建立

喂食高脂飼料4 星期后，隨機從對照組與高脂模型組分別抽取3 只小鼠，禁食12 h 過夜，眼球取血，室溫放置1 h，3 000 × g 離心10 min 取血清，利用試劑盒測定血清TC，TG 和HDL-C 濃度。摘取完整肝臟，用0～4 ℃冷生理鹽水沖洗干凈后濾紙吸干稱重，進行肝臟指數的測定。取適量肝臟，按重量（g）∶體積（mL） = 1∶9 的比例，加入9 倍體積的無水乙醇，冰水浴條件下機械勻漿，3 000 × g 離心10 min，取上清于?80 ℃冰箱保存，用于試劑盒測定肝臟TC，TG 濃度。

1.3.4 小鼠體重和臟器指數的測定

灌胃期間，每星期同一時間記錄小鼠體重。灌胃4 星期處死小鼠后立即解剖取肝、腎、脾和心臟，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干稱重，進行臟器指數測定。臟器指數（肝、腎、脾、心臟）（mg/g） = 內臟重量/小鼠處死前最終體重。

1.3.5 血清血脂、動脈硬化指數和冠心指數的測定與計算

灌胃4 星期后，全部禁食12 h 過夜，稱好體重后眼球取血制備血清離心收集血清，其中血清血脂測定方法同1.3.3，均用商業試劑盒測定血清TC，TG，HDL-C 及LDL-C 濃度，再根據公式計算動脈硬化指數AI 和冠心指數R-CHR[9]。

1.3.6 肝臟血脂測定

解剖小鼠后立即摘取完整的肝臟，用0～4 ℃冷生理鹽水沖洗干凈后，剪取適量大小肝臟，按重量（g）∶體積（mL） = 1∶9 的比例，加入9 倍體積的無水乙醇，冰水浴條件下機械勻漿，3 000×g離心10 min，取上清于?80 ℃冰箱保存，商業試劑盒測定肝臟TC，TG 和LDL-C 水平。

1.3.7 數據統計與處理

采用IBM SPSS Statistics 20.0 軟件對實驗數據進行統計分析，并進行Duncan 多重比較，概率p<0.05表示有差異，p<0.01 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠高脂模型組的建立

喂食高脂飼料4 星期后，對照組與高脂模型組小鼠體重、肝重、肝臟指數及血清TC，TG，HDL-C濃度和肝臟TC，TG 濃度見表3，圖2 和圖3。

表 3 兩組小鼠體重、肝重、肝臟指數Tab.3 Body weight, liver weight and liver index of two mice groups

圖 2 兩組小鼠血清血脂濃度Fig. 2 Serum concentration of TC, TG, HDL-C of two mice groups

圖 3 兩組小鼠肝臟血脂濃度Fig. 3 Hepatic concentration of TC, TG of two mice groups

由表3 可知，喂食高脂飼料4 星期后，高脂模型組小鼠的體重與對照組存在差異，高脂模型組小鼠肝重和肝臟指數與對照組存在顯著差異（p<0.01）。由圖2 和圖3 可知，高脂模型組血清TC 濃度和肝臟TC 濃度顯著高于對照組（p<0.01），HDLC 濃度顯著低于對照組（p<0.01）。且與對照組相比，高脂模型組小鼠肝臟顏色呈淡黃色，說明喂食高脂飼料后小鼠高脂模型建模成功。

2.2 菌株AR113 和LC2W 對高脂小鼠體重和臟器指數的影響

實驗過程中各組小鼠在灌胃各星期結束時的體重見圖4。高脂模型組和菌株LC2W 組小鼠體重相比空白對照組和菌株AR113 組有所增加但差異并不顯著（p＞0.05），可能是由于實驗周期不夠長（本實驗周期為2 個月），對體重的影響尚沒有完全表征出來。整個實驗過程，小鼠生長狀況良好，無不良反應。

臟器指數一般被用來反映某物質對臟器是否有影響，常作為毒性初步判斷指標[10]。表4 為菌株AR113 和LC2W 對高脂小鼠臟器指數的影響。由表4 可知，喂食高脂飲食的小鼠相比于普通飼料小鼠，腎臟和脾臟指數略有升高但沒有顯著差異（p＞0.05），肝臟指數升高明顯（p<0.05），說明一段時間內小鼠持續攝入過多膽固醇會對肝臟造成影響，但不影響其他器官。灌胃菌株AR113 和LC2W一個月后，小鼠肝臟指數相比高脂模型組降低明顯（p<0.05），說明菌株AR113 和LC2W 可以在一定程度上降低膽固醇在肝臟上的存積量，減輕肝臟負擔。

圖 4 菌株AR113 和LC2W 對高脂小鼠體重的影響Fig.4 Effects of AR113 and LC2W on body weight in hyperlipidemia mice

表 4 菌株AR113 和LC2W 對高脂小鼠臟器指數的影響Tab.4 Effects of AR113 and LC2W on organs index in hyperlipidemia mice

2.3 菌株AR113 和LC2W 對高脂小鼠血清血脂、動脈硬化指數和冠心指數的影響

菌株AR113 和LC2W 對高脂小鼠血清血脂及動脈硬化指數和冠心指數影響見表5。灌胃4 星期后，高脂模型組和LC2W 組小鼠血清TC，LDLC 濃度高于對照組（p<0.01）和AR113 組（p<0.05），而HDL-C 濃度又低于對照組（p<0.01）和AR113 組（p<0.05）。菌株AR113 組小鼠相比菌株LC2W 組小鼠，其血清TC，HDL-C，LDL-C 濃度更接近對照組。動脈硬化指數AI 和冠心指數R-CHR 在醫學上常被用來表示動脈粥樣硬化的危險性和發生冠心病的危險性。由表5 可知，小鼠經高脂飲食誘導后，AI 和R-CHR 均顯著升高（p<0.01），灌胃菌AR113 和LC2W后，AI 和R-CHR 相比高脂模型組都有所降低（p<0.01，p<0.05），其中菌株AR113 效果更佳。由此可知，菌株AR113 比LC2W 改善血脂代謝的效果更好，對動脈粥樣硬化和冠心病的發生有預防和改善作用。

表 5 菌AR113 和LC2W 對小鼠血清血脂水平、動脈硬化指數和冠心指數的影響Tab.5 Effects of AR113 and LC2W on serum lipid levels, AI and R-CHR in hyperlipidemia mice

2.4 菌株AR113 和LC2W 對高脂小鼠肝臟血脂的影響

由表6 可知，對照組肝臟TC，LDL-C 濃度顯著高于高脂模型組（p<0.01），菌AR113 組的肝臟TC，LDL-C 濃度又明顯低于高脂模型組（p<0.05），菌株LC2W 組的肝臟TC 濃度相比高脂模型組雖然也有所降低，但兩者之間在統計學上并沒有顯著差異（p＞0.05）。

表 6 菌株AR113 和LC2W 對小鼠肝臟TC，TG 和LDL-C 濃度的影響Tab.6 Effects of AR113 and LC2W on hepatic concentration of TC, TG and LDL-C in hyperlipidemia mice

3 討 論

血清TC 濃度升高是增加患心血管疾病的重要危險因素之一，因此近年來關于降膽固醇乳酸菌體內效果評價的實驗越來越多[11-13]。研究發現目前乳桿菌屬是具有降血脂功能的主要益生菌種類之一，大多篩選自健康人體糞便或動物糞便和酸奶、泡菜等發酵食品[14]，本實驗所用菌株AR113 和菌株LC2W 分別篩選自泡菜和發酵乳制品。

本實驗通過飼喂ICR 小鼠4 星期高脂飼料成功建立高脂模型后，再連續灌胃菌株AR113 和LC2W 4 星期，發現與高脂模型組相比，菌株AR113 組小鼠血清TC，LDL-C，AI 和R-CHR 濃度均顯著降低，分別下降了20.9%，44.8%，40.7%和32.6%，肝臟血脂TC 和LDL-C 濃度分別下降了23.2%和26.8%，而灌胃菌株LC2W 組血清血脂TC，LDL-C，AI 和R-CHR 濃度只分別下降了8.3%，11.4%，25.9%和20.8%，肝臟血脂TC 和LDL-C 濃度也只分別下降了14.3%和23.1%。由實驗綜合效果可知Lactobacillus plantarumAR113 降血脂能力遠優于Lactobacillus caseiLC2W，體現了不同菌株降血脂效果具有差異性，這與已報道的研究結果相似。張澤生等[15]利用高脂飼料誘導倉鼠高脂血癥模型，分別給不同組倉鼠灌胃濃度為109cfu/mL 的嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌菌懸液6 星期后，發現鼠李糖乳桿菌灌胃組降血清TC，TG濃度的作用最好，而嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌升高血清HDL-C 濃度的作用最好。這可能是由于雖然膽固醇生物降解的機制是多方面的，但對于菌本身而言卻是特異性的，由于菌體本身與膽固醇發生共沉淀或對膽固醇有吸附作用，也可能是由于菌體產生的膽鹽水解酶加劇了膽固醇的外排等作用。

本次實驗表明Lactobacillus plantarumAR113相比Lactobacillus caseiLC2W 對高脂血癥小鼠具有顯著的降血脂功效，可作為良好的輔助降血脂候選菌株進一步探究其體內降血脂機制，為進一步開發降血脂功能性食品提供參考。