藍舌病病毒蛋白結構與檢測方法研究進展

史衛軍 ， 黃超華 ， 曹琛福 ， 林彥星 ， 王 瀟 ， 花群義

(1.深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心 ， 廣東 深圳 518045 ； 2.華南農業大學獸醫學院 ， 廣東 廣州 510642)

藍舌病(Bluetongue, BT)是由藍舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起，經庫蠓、伊蚊等媒介昆蟲傳播感染反芻動物的烈性非接觸性傳染病。1876年首次在南非被發現[1],1906年Theiler正式命名為“藍舌病”，將引起該病的病毒命名為藍舌病病毒[2]。20世紀初，伴隨國際貿易的發展，BT隨后傳入美洲、亞洲、歐洲等地，中國1979年首次發現該病的存在。BTV主要引起綿羊發病和死亡，牛和山羊常為隱性感染，反芻動物感染后平均死亡率為35%，易感綿羊死亡率可高達80%[3-4]。藍舌病的分布與中間宿主的活動范圍有很大關系，大致分布在北緯40°和南緯45°區域之間，一些地區在北緯50°內也檢測到BTV，這種分布情況的改變可能與全球氣候變暖有關。藍舌病因分布范圍廣、危害大，被世界動物衛生組織(OIE)列為須法定報告的動物疫病，中國將其列為一類動物疫病[5]，也是我國出入境口岸重點檢疫的外來動物疾病。本文簡述了藍舌病病毒蛋白結構及診斷方法，旨在為進一步研究病毒和新的檢測方法提供參考。

1 病毒結構

BTV是呼腸孤病毒科(Reoviridae)環狀病毒屬(Orbivirus)藍舌病病毒亞群(Bluetonguevirussub-group)的成員。完整的BTV粒子為圓形、無囊膜的二十面立體對稱結構，核衣殼直徑為53～60 nm，加上衣殼外細絨毛狀層，總直徑為70～80 nm，是目前分子質量最大的RNA病毒[6]。迄今為止，全世界范圍內共分離到27種不同血清型的BTV[7]，不同的血清型之間無交叉保護作用[8]。有研究表明，相繼在中東和南非檢測到28型和29型BTV[9]。我國引起藍舌病的主要病原為1型和16型。

BTV由10個大小不等的雙鏈RNA基因片段組成，其分段基因組RNA3′和5′端各含有特異的重復保守序列，為5′-GUUAAA 和3′-ACUUAC[10]。10個獨立的RNA片段分別命名為L1～3、M4～6、S7～10，可編碼7種結構蛋白(VP1～7)和4種非結構蛋白(NS1～4)。除S10節段外每個節段只編碼一種蛋白[11]。BTV具有雙層衣殼結構，最外層由VP2(111 kDa)和VP5(59 kDa)構成，核心衣殼由VP3(100 kDa)和VP7(38 kDa)2種主要結構蛋白和VP1(149 kDa)、VP4(76 kDa)、VP6(36 kDa)3種次要結構蛋白構成。4種非結構蛋白可能參與了BTV的復制、“裁剪”和運輸，是在被BTV感染的細胞中合成的[12]。

2 病毒蛋白

2.1 外衣殼蛋白VP2、VP5 VP2和VP5構成包裹BTV核心顆粒的外層衣殼，約占BTV總蛋白量的40%。外殼蛋白在病毒吸附靶細胞和進入細胞過程中發揮關鍵性作用，研究發現，除去VP2或VP2及VP5后的BTV核心顆粒對哺乳動物細胞不具有感染能力，但對昆蟲細胞更具感染性。

VP2由L2基因編碼，位于病毒粒子的最外層，是病毒的主要型特異性抗原和血凝素蛋白，BTV的血清型特異性抗原決定簇主要存在于VP2中。VP2由950～960個氨基酸組成，不同血清型之間氨基酸序列變化范圍為22.7%～72.9%，各血清型缺乏有效交叉免疫保護。相同血清型不同地域不同毒株的VP2蛋白的核苷酸序列，最大的差異可以達到30%。VP2蛋白能與宿主細胞表面的血型糖蛋白A結合，參與病毒的吸附和進入，缺失VP2的病毒不能結合細胞，也不具有感染細胞的能力。VP2可以誘導產生中和抗體，并對同一血清型病毒產生免疫保護。

VP5由M5基因編碼，以三聚體形式整齊分布在病毒粒子表面，大小為526個氨基酸。VP5也是型特異性抗原，但更加保守，不同血清型BTV間同源性為70%以上，產生的中和抗體具有群特異性，在一定程度上可以反映病毒的地域來源。VP5與病毒的毒力有關，調節病毒粒子從內吞泡釋放到細胞質，增強細胞膜透性化。VP5在VP2免疫中和反應中起增強作用，對研究BT疫苗具有重要意義。

2.2 內衣殼蛋白VP3和VP7 VP3和VP7是BTV核衣殼的2種主要蛋白，與3種次要蛋白共同組成包裹基因組的內層衣殼，保持著BTV核心結構的完整性。

VP3由L3基因編碼，位于病毒衣殼最內層，有903個氨基酸殘基，高度保守，屬群特異性抗原。VP3蛋白分為A和B兩種構型，2種構型形成閉合的亞核芯層結構，為VP7三聚體的附著提供了支架。亞核芯層同時與內部的VP1、VP4、VP6及dsRNA緊密結合，在維持病毒核芯顆粒結構的完整性起重要作用。研究發現，VP3與BTV的毒力無關。

VP7由S7基因碼編，以三聚體的形式存在于VP3蛋白表面，大小為349個氨酸基，至少有2個表位暴露，是BTV主要的血清群特異性抗原，在病毒的復制和傳播中起重要作用。位于VP7蛋白255處的賴氨酸殘基對病毒內衣殼的形成起著必不可少的關鍵作用[13]。VP7在不同血清型中具有高度保守性和較強的抗原性，26種不同血清型中其氨基酸殘基的同源性達到98%。細胞被BTV感染后，VP7是最早被檢測出的抗原，動物被感染后，VP7抗體也是機體產生的主要抗體之一，所以VP7是建立BTV群特異性血清學檢測方法的最佳抗原[14]。在缺乏VP2或VP5的情況下，VP7也可介導BTV對昆蟲細胞吸附和侵入。

2.3 核芯蛋白VP1、VP4、VP6 VP1、VP4、VP6三種核芯蛋白與內衣殼蛋白和10條基因組共同組成BTV核心顆粒。3種核芯蛋白具有酶活性，參與轉錄及加帽裝飾等過程。

VP1由L1基因編碼，長1 302個氨酸基，是BTV蛋白質中最大的蛋白，分子重量為149.5 kDa，但在病毒粒子中占的比列很少，每個病毒粒子中大約只有12個拷貝。VP1具有RNA聚合酶活性，并對Mg2+具有依賴性，可以寡聚核苷酸A為引物延伸RNA的合成，并能作為BTV復制酶以正鏈RNA為模板合成雙鏈RNA。在27～37 ℃之間VP1的活性最大，能在昆蟲細胞和哺乳動物中進行有效的復制。

VP4由M4基因編碼，長654個氨基酸，主要作為鳥苷酸轉移酶參與病毒mRNA的合成。早期的藍舌病病毒mRNA并不具有生物活性，需要加帽修飾才能使mRNA更穩定和高效翻譯，參加這一裝飾過程的4種酶都需要VP4蛋白進行催化。另外，VP4細長的模塊化晶體結構也為病毒粒子的有效裝配提供了支架[15]。

VP6由S9基因編碼，長328個基氨酸。VP6免疫原性很強，但較保守，被認為是一種群特異性抗原，可以誘導高滴度的特異性抗體產生。VP6還具有ATP結合活性，能展開BTV的雙鏈并輔助mRNA的合成。

2.4 非結構蛋白NS1、NS2、NS3、NS3A 和NS4 目前，在BTV感染的細胞中已經檢測到4種非結構蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a、NS4)。4種非結構蛋白在不同血清型BTV之間保守性很強，它們在病毒粒子的組裝和運輸過程中起重要作用。研究發現，非結構蛋白在區分受BTV感染動物和接種疫苗動物鑒別診斷方面也具有很大潛力。

NS1由M6基因編碼，含有552個氨基酸，分子量64 kDa，是BTV最大的一個非結構蛋白,也是藍舌病病毒編碼的蛋白中表達量最高的。NS1在不同血清型的BTV之間高度保守，基因相似性達80%～90%，為一種型特異性抗原。電子顯微鏡下觀察被BTV感染的細胞，可以看到大量的病毒特異性小管(直徑52.3 nm，長1 000 nm)組成的多聚體NS1蛋白。有試驗證實，這些小管可以選擇性促進BTV單鏈RNA的翻譯，增加病毒滴度[16]。研究發現，NS1的表達量可能會決定病毒的釋放方式，影響到病毒對細胞的損傷程度。

NS2由S8基因編碼，含有357個氨基酸，蛋白分子大小約為42 kDa。主要存在于被感染細胞的細胞核附近，聚集病毒基因組復制及核心組裝所需的病毒單鏈RNA和蛋白成分，形成病毒包涵體(VIBs)。NS2是BTV感染細胞中唯一確定的磷蛋白，具有良好的抗原性，可以與單鏈RNA結合，并可以使三磷酸核苷酸水解成單磷酸核苷酸。這表明NS2蛋白在病毒復制過程中起重要作用。

NS3由BTV基因組中長度最小的S10基因編碼，S10基因有2個開放閱讀框，分別編碼具有229個氨基酸的NS3(25.5 kDa)和216個氨基酸的NS3a(24 kDa)。NS3a與NS3相比，缺少了N端的13個氨基酸，兩者氨基酸序列及核苷酸序列都具有高度保守性，高達82%～99%，具有群抗原特異性。NS3在BTV復制和形成過程中在宿主細胞中產生，先集聚在細胞高爾基體上，后轉移到宿主細胞膜上以糖基化的膜蛋白存在。NS3/NS3A蛋白在哺乳動物細胞中的表達量相對較少，僅可以勉強檢測出來，但在昆蟲細胞中具有很高的表達量，因此這2種蛋白可能的主要作用是參與了BTV在昆蟲體內的傳播。NS3是BTV編碼的唯一膜蛋白，二級結構具有2個跨膜螺旋，其氨基酸序列的118～148位點和156～181位點形成螺旋結構跨越整個細胞膜。研究發現，NS3與VP2相互作用，通過招募ESCRT-I蛋白Tsg101來幫助病毒從感染細胞中釋放[17]。

NS4是2011年發現的一種新型非結構蛋白，位于BTVS9基因上，與VP6的ORF相重疊，含有77～ 79個氨基酸殘基，分子量10 kDa，高度保守，NS4的N端富含堿性氨基酸，C端有亮氨酸拉鏈結構[18]。試驗證實，其在病毒感染早期表達，是復制非必需蛋白，具有非典型核定位信號，在干擾素應答適應性和小鼠致病性中扮演著重要角色[19]。

3 檢測方法

3.1 病原學檢測 病毒分離鑒定是世界動物衛生組織(OIE)推薦的藍舌病診斷方法之一。BTV可在10～11日齡雞胚、易感細胞(如蚊子細胞C6/36、倉鼠腎細胞BHK-21、非洲綠猴腎細胞Vero等)和綿羊身上增殖。雞胚接種與細胞培養相結合是目前分離BTV最敏感和有效的方法。我國BTV分離鑒定的方法主要依據《藍舌病診斷技術》(GB/T18636-2017)和《藍舌病病毒分離、鑒定及血清中和抗體檢測技術》(GB/T18089-2008)進行，基本步驟為：病料采集及制備(全血、肝、脾、腎、淋巴結、精液、庫蚊)-雞胚靜脈接種-接種C6/36細胞-BHK21或Vero細胞盲傳3代以上-鑒定、定型。

3.2 血清學檢測

3.2.1 瓊脂糖免疫擴散試驗(AGID) AGID為最早推廣應用的抗體檢測方法之一，也是OIE推薦使用的方法。1962年，Klontz最先應用AGID檢測藍舌病病毒群特異性抗體，我國目前仍在使用該方法診斷藍舌病。瓊脂擴散試驗用從BTV在BHK-21或Vero細胞培養物提取的可溶性抗原，與待檢血清在瓊脂糖凝膠中進行免疫沉淀反應，同時設陰、陽性血清對照,室溫放置24 h后，有沉淀線出現的為藍舌病病毒抗體陽性。該法簡便易行，可以在沒有復雜實驗設備條件下對大量血清樣品進行低成本檢驗。缺點是靈敏性和特異性稍差，與環狀病毒及其他病毒如流行性出血病病毒(EHDV)等存在交叉反應，容易受到抗原的水溶解性、決定簇數量和分子量、抗原和抗體的比例、pH 值等不同條件的影響[20]。

3.2.2 血清中和試驗(MTSN) 主要方法為將56 ℃滅活后的待檢血清倍比稀釋后與不同血清型BTV在37 ℃，5%CO2培養箱進行孵育，同時設平行組和對照組，72～168 h后通過觀察細胞病變效應(CPE)情況來判定結果，當被檢血清孔50%出現保護的，判定為陽性，該孔此時的血清稀釋度即為該份血清的中和抗體滴度。有人對自然感染動物和人工接種動物進行了血清效價監測，發現自然感染康復綿羊的中和抗體滴度可達1∶160以上，遠高于人工接種綿羊。MTSN的特異性和敏感性較強，可用于BTV型特異性抗體的檢測及分離。不足是準確性和測定效價會受細胞培養條件、培養液成分及細胞類型等因素影響。

3.2.3 過氧化物酶染色法(IPS) 該方法是利用標記抗體來檢測蛋白抗原，包括間接過氧化物酶檢測法(IP)、熒光抗體檢測法(FA)及過氧化物抗過氧化物酶檢測法(PAP)等3種方法。其中敏感性最高的是IP中以抗生物素及生物素的復合物標記過氧化物酶為基礎的ABC- IP檢測方法，已在生產實踐中得到應用。IPS缺點是制備抗原蛋白和相應單克隆抗體操作繁瑣，無法長期保存原材料。

3.2.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) ELISA是最常用的血清學檢測方法。20世紀80年代，國外已先后報道了BTV間接ELISA、阻斷ELISA、競爭性ELISA檢測方法的建立。競爭性ELISA方法為OIE推薦的BTV血清學診斷方法，也是檢測BTV最敏感的檢測方法，該方法主要使用抗NS1蛋白單抗和抗VP7蛋白單抗，可用來檢測任何感染動物體內的藍舌病抗體，且與其他環狀病毒不會出現交叉反應。近年來，國內外學者以VP5、VP2、VP3、VP7、NS1、NS3等特異性抗原及基因表達抗原建立了不同的ELISA檢測方法，特異性和靈敏性都較高。ELISA方法具有特異性高、操作簡便、耗時少、結果便于觀察等優點，所以目前被廣泛研究和應用。

3.3 分子生物學檢測

3.3.1 聚合酶鏈式反應檢測技術(PCR) PCR是一種快速的體外DNA片段擴增技術，在BTV的血清型分類、核酸研究及病毒檢測上得到了廣泛應用。PCR技術以藍舌病病毒mRNA為模板反轉錄獲得cDNA，再以此為模板進行PCR擴增得到BTV片段，經過限制性酶切后電泳進行分析。目前采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和序列分析是用來進行BTV檢測和鑒定非常有效的分子診斷技術，該方法具有靈敏度高、特異性強、產率高、重復性好等特點，適用于感染早期病毒量少時的臨床檢測。采用巢式RT-PCR檢測血液和組織中的BTV已被OIE推薦為國際貿易采用方法，具有特異、快速、靈敏等優點。實時熒光定量PCR技術(FQ-PCR)利用熒光信號累積實時監測擴增產物的量，在一定程度上實現了定量檢測的目的，其靈敏度及特異性高，操作簡便快捷，缺點是易被擴增抑制物抑制和出現假陽性。

3.3.2 核酸分子雜交技術 核酸分子雜交技術是利用不同來源的DNA單鏈與RNA鏈彼此有互補的堿基序列而結合來檢測相應的病原核酸。在BTV核苷酸序列的檢測中，設計BTV cDNA探針，通常分子探針制備選取cDNA片段L2、L3、S7、M6，利用其與BTV病毒RNA進行核酸雜交以檢測BTV抗原。盡管核酸分子雜交法具有敏感性強、特異性高、耗時短等特點，但過程十分繁瑣，而且對實驗條件、實驗技能要求也相對較高，并不適用于常規的病原檢測。

4 小結

藍舌病病毒是結構最復雜的RNA病毒之一，由多種病毒蛋白和多節段的RNA基因組構成，有27種血清型，不同的血清型之間無交叉保護作用。近年來受全球氣候變暖及國際貿易的影響，藍舌病在全球呈現出擴大的流行趨勢，病毒部分血清型的遺傳特性也在發生改變，導致病毒毒力改變、致病力增強，不僅造成了嚴重的經濟損失，也給研究和防治工作帶來了較大的挑戰性。快而準的檢測是控制和消滅藍舌病的基礎，盡管現在已經建立了許多BTV的檢測和鑒定方法，但仍存在檢測成本高、步驟繁瑣、周期長、結果不穩定、識別抗原單一等問題，需要通過研究進行完善和優化。因此，了解藍舌病病毒結構功能及檢測現狀，對于進一步探索新的檢測方法和疫病防制都具有重要意義。